Summary
이 논문은 정액에서 과산화효소 양성 백혈구를 검사하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) 시스템의 도움으로 정액의 과산화효소 양성 백혈구 농도를 총 60분 이내에 얻을 수 있어 남성학 실험실 및 남성학자의 효율성을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다.
Abstract
백혈구 정자증은 정자 운동성 감소, 정자 형태학적 이상 증가, 정자 DNA 단편화 지수 증가, 정자 아크로솜 기능 손상, 심지어 배아 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 임상에서 흔히 볼 수 있는 남성학적 질환이며 남성 불임의 중요한 원인 중 하나입니다. 남성 생식기 염증의 존재 여부를 결정할 때, 남성의학 전문의는 종종 임상 진단 근거로 정액의 원형 세포 또는 정액 혈장 엘라스타제를 검사합니다. 그러나 원형 세포의 검사는 무분별하고 불필요한 항생제 사용을 줄이는 데 기여하지 않는 정자 생성 세포와 생식관 상피 세포에 의해 쉽게 영향을 받습니다. 동시에 엘라스타제의 검출 과정은 상대적으로 복잡하고 시간이 많이 걸리며 결과 보고가 느리기 때문에 남성 생식기 감염(MGTI)과 같은 질병의 조기 진단 및 치료에 도움이 되지 않습니다. 백혈구 정자증의 진단 기준으로 CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) 시스템을 통해 정액에서 과산화효소 양성 백혈구 검사를 혁신적으로 적용하여 이러한 문제를 성공적으로 해결하였습니다. 이 검사는 4개의 시약으로 구성된 사용 유체를 시료에 추가하기만 하면 되며 실온에서의 총 반응 시간은 20-30분 이내에 제어할 수 있습니다. 후속 도말 및 현미경 검사를 통해 총 60분 이내에 정액 내 과산화효소 양성 백혈구 농도를 얻을 수 있으며, 이는 남성 생식관의 염증 존재 여부를 진단하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
불임은 가임기 부부의 약 15%에 영향을 미치는 글로벌 공중 보건 문제로 부상했습니다. 전체 난임 사례의 약 50%가 남성 요인에 기인하며, 거의 20%에서 30%는 남성 요인에 기인할 수 있다 1,2,3. 남성 생식기 감염(MGTI)은 남성 불임의 중요한 원인 중 하나로, 전체 불임 사례의 약 15%를 차지한다 4,5.
대부분의 개인은 정액에 백혈구를 가지고 있으며, 이는 비정자 세포의 13%를 구성하며, 호중구 12%, 대식세포 0.9%, 림프구 0.1%6,7의 차등 비율이 있습니다. 세계보건기구(WHO)의 인간 정액 검사 및 처리 실험실 매뉴얼(5판)에 따르면, 백혈구 정자증은 일반적으로 정액에 >1 × 106 cells/mL 백혈구가 존재하는 것으로 정의된다8. 이 질환은 환경 독소, 약물 남용, 정맥류, MGTI 등과 같은 다양한 요인에 의해 발생할 수 있으며, 이 모든 요인은 정액 내 백혈구 농도의 비정상적인 증가로 이어질 수 있다9. 백혈구는 정액의 활성산소종(ROS) 수치를 높여 단백질과 DNA에 지질 과산화 및 산화적 손상을 일으켜 정자 운동성 감소, 정자 형태학적 이상 증가, 정자 DNA 단편화 지수 상승, 정자 아크로솜 기능 손상, 심지어 배아 발달에 부정적인 영향을 미칠 수 있다10,11.
현재 남성의학 전문의들은 생식기 염증을 확인할 때 정액의 둥근 세포나 정액 혈장의 엘라스타제를 검사하는 것이 일반적입니다. 그러나 무분별하고 불필요한 항생제 사용을 줄이는 데 기여하지 않는 정자 생성 세포와 생식관 상피 세포를 구별하는 것은 종종 어렵다6. 후자의 검사 방법은 상대적으로 복잡하고 시간이 많이 걸리며 결과 보고가 느리기 때문에 MGTI와 같은 질병의 조기 진단 및 치료에 도움이 되지 않습니다. 미국 비뇨기과학회(American Urological Association, AUA)는 정액 분석에서 원형 세포 농도가 1 × 106 cells/mL12 이상일 때 생식기에서 백혈구와 축출된 세포를 추가로 구별해야 한다고 제안한다. 일부 남성학 실험실에서는 백혈구를 검사하기 위해 유세포 분석(flow cytometry)13 또는 백혈구 항원(le-g., CD45) 면역세포화학(immunocytochemistry)14 을 이용한다. 이러한 방법은 정확하지만 비용과 시간이 많이 소요되어 특히 개발도상국에서 대규모 임상 구현이 어렵습니다.
과산화효소는 다양한 유형의 세포에 널리 분포되어 있으며 산화 스트레스 손상에 대한 저항력에 중요한 역할을 합니다. 골수화효소(MPO)는 일반적으로 면역 세포에서 발현되는 과산화효소 아과(subfamily)의 구성원입니다. 호중구의 azurophilic granules 15,16에서 가장 많이 발현되며 림프구 17,18, monocyte 및 macrophage 19에서도 발현됩니다. 정액에서 백혈구, 특히 호중구의 농도는 과산화효소 양성 7,20인 둥근 세포를 검사하여 얻을 수 있습니다. 정액 내 백혈구 검사 과정을 경제적이고 편리하며 효율적으로 만들기 위해 검사 방법을 재설계했습니다. CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) 시스템의 도움을 받아 60분 이내에 백혈구 농도를 얻을 수 있습니다. 이 새로운 방법은 환자의 검사 비용과 결과를 얻기 위한 대기 시간을 줄이고 실험실 기술자의 작업량을 줄이며 의사의 진단 및 치료 대기 시간을 단축합니다.
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Protocol
이 연구는 Sun Yat-sen University의 제 3 부속 병원 의료 윤리 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.
1. 작업 용액의 준비
- 작업 용액을 준비하는 데 필수적인 다음 시약인 오르토 톨루이딘 기질 용액, 포화 염화암모늄(NH4Cl) 용액, 148mmol/L 에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐염(Na2EDTA) 용액 및 6%(v/v) 과산화수소 용액. 이송 피펫(1000 μL, 200 μL, 10 μL) 및 시험관 랙과 같은 필요한 도구와 함께 실온(RT) 실험실 벤치에 놓습니다.
주의 : 위에서 언급한 시약을 취급하기 전에 안전보건자료(SDS)를 읽으십시오. - 준비된 작업 용액을 저장하고 빛에 노출되지 않도록 보호하기 위해 불투명한 갈색 시약 병을 준비합니다.
- 아래 지정된 비율에 따라 시약을 불투명한 갈색 시약 병에 옮깁니다.
- 200 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 100 μL로 조정합니다. 그런 다음 100μL의 NH4Cl용액을 불투명한 갈색 시약 병에 옮깁니다.
- 피펫 팁을 교체하고 위에서 언급한 200μL 이송 피펫을 사용하여 148mmol/L Na2EDTA 용액 100μL를 불투명한 갈색 시약 병에 옮깁니다. 그런 다음 피펫팅으로 부드럽게 불어 용액을 완전히 균질화합니다.
- 1000 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 900 μL로 조정합니다. 그런 다음 900μL의 오르토-톨루이딘 기질 용액을 불투명한 갈색 시약 병에 옮기고 피펫팅으로 부드럽게 불어 용액을 완전히 균질화합니다.
- 10 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 5 μL로 조정합니다. 그런 다음 6%(v/v) 과산화수소 용액 5μL를 불투명한 갈색 시약 병에 옮깁니다.
- 1000 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 1000 μL로 조정합니다. 피펫 팁을 교체하고 피펫팅으로 부드럽게 불어낸 다음 불투명한 갈색 시약 병에 용액을 완전히 균질화합니다.
- 바로 사용할 수 있는 작업 용액을 불투명한 갈색 시약 병에 담아 빛에서 멀리 떨어진 RT에 보관하십시오. 작업 솔루션은 24시간 동안 반응합니다.
- 각 정액 샘플에는 900μL의 작업 용액이 필요합니다. 매일 준비되는 작업 용액의 양이 매일 검사되는 샘플의 수와 일치하는지 확인하십시오.
2. 정액 샘플 준비
- 정액 샘플을 채취하기 전에 환자가 인간 정액 검사 및 처리를 위한 세계보건기구(WHO) 실험실 매뉴얼(5판)에서 요구하는 대로 2-7일 동안 사정을 자제했는지 확인하십시오. 8. 자위는 정액 샘플을 얻기 위해 선호되는 방법입니다. 검사의 정확도를 높이려면 환자에게 사정된 정액을 모두 채취하도록 지시합니다.
- 항온 스탠드를 켜고 정액 샘플의 후속 액화가 원활하게 진행될 수 있도록 미리 37°C까지 가열합니다.
- 환자의 정액 샘플을 받으면 식별 코드, 수집 시간, 금욕 기간 및 기타 관련 정보를 포함한 세부 정보를 폴리머 기반 용기의 외벽에 꼼꼼하게 기록합니다.
- 정액 샘플을 수용하는 폴리머 기반 용기를 37°C로 예열된 항온 스탠드에 놓으면 정액 액화에 유리합니다.
- 정액 샘플을 폴리머 기반 피펫에 넣고 정액 샘플이 완전히 액화될 때까지 5분마다 액화 상태를 관찰합니다.
- 정액 샘플이 30분 이내에 완전히 액화되지 않으면 아직 검사를 수행하지 마십시오. 30분 더 기다립니다. 60분 후에도 정액이 완전히 액화되지 않으면 동일한 양의 인산염 완충 용액을 첨가하여 1:1로 희석하고 부드럽게 저어 액화를 촉진합니다.
- 철저한 교반과 일관된 균질화 후 후속 검사 절차를 위해 완전히 액화된 정액 샘플을 보관합니다.
3. 과산화효소 양성 백혈구의 염색 및 원본 정액 샘플 분석
- 샘플링 전에 폴리머 기반 피펫을 사용하여 피펫팅으로 반복적으로 불고 검사 중인 정액 샘플을 완전히 균질화합니다.
- 200 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 100 μL로 조정합니다. 피펫 팁을 교체한 다음 정액 샘플 100μL를 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 1000 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 900 μL로 조정합니다. 피펫 팁을 교체한 다음 위에서 언급한 작업 용액 900μL를 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
- 피펫팅으로 반복적으로 불고 1000μL 이송 피펫을 사용하여 정액 샘플과 작업 용액으로 구성된 반응물을 완전히 균질화합니다.
- 원심분리기 튜브를 2차원 셰이커의 시험관 랙에 놓고 RT에서 200분 동안 30rpm으로 연속 교반합니다.
- 염색 반응을 기다리는 동안 CASA 시스템을 사용하여 정액 샘플을 분석하여 폴리머 기반 용기의 원래 정액 샘플에서 정자 농도를 결정합니다.
- CASA 시스템의 전원 스위치를 켜고 SCA SCOPE 아이콘을 두 번 클릭하여 응용 프로그램 소프트웨어를 엽니다.
- 샘플링 전에 피펫팅으로 반복적으로 불고 폴리머 기반 피펫으로 원래 정액 샘플을 다시 완전히 균질화합니다.
- 10 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 10 μL로 조정합니다. 피펫 팁을 교체하고 원래 정액 샘플의 10μL를 피펫팅한 다음 SCA 계수 챔버에 넣습니다. 정액 샘플이 표류를 멈출 때까지 60초 동안 기다립니다.
- SCA 계수 챔버를 CASA 시스템의 샘플 홀더에 배치하고 애플리케이션 소프트웨어의 대화 상자에서 환자 정보를 설정하여 공식 검사를 준비합니다.
- 시작 버튼을 클릭하여 CASA 시스템이 있는 SCA 계수 챔버에서 원본 정액 샘플을 검사하고 정자 농도와 같은 필요한 데이터를 기록합니다.
4. 과산화효소 양성 백혈구와 정자의 관찰
- 1000 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 1000 μL로 조정합니다. 피펫 팁을 교체한 다음 피펫팅으로 반복적으로 불고 30분 반응 과정이 끝나면 원심분리기 튜브에서 정액 샘플과 작업 용액으로 구성된 반응물을 완전히 균질화합니다.
- 10 μL 이송 피펫을 사용하고 손잡이를 돌려 스케일을 10 μL로 조정합니다. 피펫 팁을 교체하고 위에서 언급한 반응물 10μL를 피펫팅한 다음 정자 계수 챔버에 넣습니다. 마지막으로 전용 유리 커버슬립으로 정자 계수 챔버를 덮습니다.
- 정자 계수 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 두 개의 10x 접안렌즈로 광학 현미경의 전원 스위치를 켭니다. 그런 다음 반응물 샘플이 표류를 멈출 때까지 60초 동안 기다립니다.
- 대기 시간 동안 현미경 변환기를 10x 대물 렌즈로 전환하십시오. 그런 다음 거친 조정 노브와 미세 조정 노브를 순서대로 조정합니다. 마지막으로 10×10의 배율로 정자와 둥근 세포를 관찰합니다.
- 분석할 시야를 결정한 후 현미경 변환기를 40x 대물 렌즈로 전환하고 10× 40의 배율에서 정자 및 갈색 과산화효소 양성 백혈구를 관찰합니다.
- 전자 계수기 시스템을 활용하여 해당 필드 내에서 최소 200개의 정자와 갈색 과산화효소 양성 백혈구의 수를 계산합니다.
5. 과산화효소 양성 백혈구의 농도 계산
- 다음 공식을 사용하여 과산화효소 양성 백혈구의 농도를 계산합니다.
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Representative Results
앞서 언급한 절차를 구현하면 원심분리 튜브의 반응물이 반투명하고 유백색 모양으로 나타나는 경우가 많습니다(그림 1). 명백한 갈색을 검출하면 백혈구의 잠재적인 탈과립이 드러나며, 이로 인해 액체 염색이 발생할 수 있습니다. 결과적으로, 염색 과정이 실패할 수 있으며, 재검사를 위해 다시 염색하거나 새로운 정액 샘플을 채취해야 할 수 있다21.
과산화효소 양성 백혈구는 염색되지 않은 일반 원형 세포와 대조되는 갈색 색조를 나타냈습니다(그림 2, 일반 슬라이드). 그 후, 현재 현미경 필드 아래의 모든 정자 및 갈색 백혈구는 지속적인 관찰 및 집계를 위해 완전히 새로운 필드로 이동하기 전에 계수되었습니다. 최적의 정확도를 보장하려면 최소 200개의 정자와 해당 시야에 존재하는 백혈구를 계산해야 합니다.
그림 1: 반응물 용액. 반응 과정을 완료하는 반응물은 반투명 유백색 액체입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 광학 현미경으로 관찰한 모습(일반 슬라이드). (A) 과산화효소 양성 백혈구 및 (B) 10 x 40 배율 광학 현미경으로 관찰된 일반 원형 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
오르토톨루이딘과 과산화수소는 감광성을 가지며 빛에 노출되면 분해될 수 있습니다. 테스트 시약의 효과를 보장하려면 준비된 작동 유체를 어두운 곳에 보관하는 것이 좋습니다.
정액 샘플은 자연적으로 이질적인 특성을 나타냅니다. 정액 샘플의 준비 과정에서 정액의 액화 상태를 정확하게 판단하고 각 샘플링 전에 정액 샘플을 완전히 균질화하는 것은 테스트 결과의 신뢰성을 높이는 데 중요합니다. 정액 샘플은 15분 이내에 완전히 액화됩니다. 기계적 균질화 또는 효소 분해는 60분 후에도 완전히 액화되지 않은 경우 고려해야 합니다. 보다 균질한 정액 샘플은 2차원 셰이커(8)를 사용하여 액화 과정 동안 샘플 용기를 연속적으로 부드럽게 흔들어 얻을 수 있다.
이 논문에서 제시하는 검사 방법은 단순성, 속도 및 비용 효율성의 장점을 가지고 있습니다. 그러나, 특정 상황에서는 유리하지 않을 수 있다: 퍼옥시다제는 활성화 시 탈과립화 또는 사이토펨프시스를 통해 세포간 공간으로 분비되는 azurophilic 과립에 저장된다21,22. 결과적으로 호중구는 염색에 실패하고 식별되지 않을 수 있습니다. 이러한 경우 염색 과정을 반복하거나 환자에게 재검사를 위해 새로운 정액 샘플을 제공하도록 요구해야 합니다. 이러한 상황을 최소화하기 위해 가능한 한 최소한의 배치 시간과 부드러운 균질화 공정으로 신선한 정액 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 활동성 질환 또는 감염만 확인할 수 있으며, 만성 감염과 같은 후기 단계의 질병은 식별할 수 없다16. 또한 림프구, 대식세포 및 단핵구와 같이 과산화효소 함량이 낮은 다른 유형의 백혈구는 이 방법을 사용하여 염색하는 데 어려움을 겪습니다. 따라서 백혈구 항원(예: CD45) 면역조직화학적 염색을 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.
세계보건기구(WHO) 매뉴얼 제5판에서 요구하는 바와 같이, 전통적인 양성 골수과산화효소 염색(Endtz 검사)은 혈구 계수판에서 최소 200개의 과산화효소 양성 백혈구를 현미경으로 계수하여 농도를 계산해야 한다8. 기존의 수동 Endtz 테스트와 비교하여 이 프로토콜은 수동 및 자동 방법을 결합하여 CASA 검출로 얻은 정자 농도 데이터를 도입합니다. 과산화효소 양성 백혈구의 농도를 계산하기 위해, 해당 시야에 있는 최소 200개의 정자 및 백혈구를 현미경으로 계수하였다. 정액의 정자 농도는 백혈구의 농도보다 훨씬 높기 때문에 200개의 과산화효소 양성 백혈구를 세는 것에 비해 200개의 정자를 세는 데 더 적은 시간이 필요했습니다.
중증 희소정자증, 크립토주정자증 및 무정자증 환자는 종종 충분한 수의 정자를 세는 데 어려움을 겪습니다. 이러한 경우, 과산화효소 양성 백혈구의 농도는 플레이트 매뉴얼에 설명된 대로 혈액 세포 계수 플레이트를 사용하여 직접 계산할 수 있습니다. 또한 CASA가 필요하지 않은 환자나 CASA 장비가 없는 실험실의 경우 혈구 계수 플레이트를 사용하여 과산화효소 양성 백혈구의 농도를 측정할 수도 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 이 연구를 위한 시설을 제공한 Sun Yat-sen University의 제3 부속 병원인 Center for Reproductive Medicine의 Andrology Laboratory에 감사드립니다. 이 기사를 준비하는 데 자금이 투입되지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
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