Die Untersuchung von Peroxidase-positiven Leukozyten im Sperma
Summary
In dieser Arbeit wird ein wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Untersuchung von Peroxidase-positiven Leukozyten im Sperma vorgestellt. Mit Hilfe eines computergestützten Samenanalysesystems (CASA) kann die Konzentration von Peroxidase-positiven Leukozyten im Sperma innerhalb von insgesamt 60 Minuten ermittelt werden, wodurch die Effizienz des andrologischen Labors und der Andrologen effektiv verbessert wird.
Abstract
Leukozytospermie kann zu einer verminderten Beweglichkeit der Spermien, zu vermehrten morphologischen Anomalien der Spermien, zu einem erhöhten DNA-Fragmentierungsindex der Spermien, zu einer Beeinträchtigung der Funktion des Spermienakrosoms und sogar zu einer Beeinträchtigung der Embryonalentwicklung führen. Es ist eine häufige andrologische Erkrankung in der klinischen Praxis und eine der Hauptursachen für männliche Unfruchtbarkeit. Bei der Feststellung, ob eine Entzündung des männlichen Fortpflanzungstrakts vorliegt, entscheiden sich Andrologen häufig für die Untersuchung runder Zellen oder der Samenplasma-Elastase im Sperma als klinisch-diagnostische Grundlage. Die Untersuchung von runden Zellen wird jedoch leicht durch abgestreifte spermatogene Zellen und Epithelzellen des Fortpflanzungstrakts beeinflusst, die nicht dazu beitragen, den wahllosen und unnötigen Einsatz von Antibiotika zu reduzieren. Gleichzeitig ist der Nachweisprozess der Elastase relativ kompliziert, zeitaufwändig und langsam in der Berichterstattung über die Ergebnisse, was für die Frühdiagnose und Behandlung von Krankheiten wie Infektionen des männlichen Genitaltrakts (MGTIs) nicht von Vorteil ist. Wir haben die Untersuchung von Peroxidase-positiven Leukozyten im Sperma mit Hilfe eines computergestützten Samenanalysesystems (CASA) als diagnostisches Kriterium für Leukozytospermie innovativ angewendet und diese Probleme erfolgreich gelöst. Für diese Untersuchung muss nur die aus vier Reagenzien bestehende Betriebsflüssigkeit in die Probe gegeben werden, und die Gesamtreaktionszeit bei Raumtemperatur kann innerhalb von 20-30 min gesteuert werden. Mit dem anschließenden Abstrich und der mikroskopischen Untersuchung kann innerhalb von insgesamt 60 min die Konzentration von Peroxidase-positiven Leukozyten im Sperma ermittelt werden, anhand derer diagnostiziert werden kann, ob die Entzündung des männlichen Fortpflanzungstraktes vorlag.
Introduction
Unfruchtbarkeit hat sich zu einem globalen Problem der öffentlichen Gesundheit entwickelt, von dem etwa 15 % der Paare im gebärfähigen Alter betroffen sind. Etwa 50 % der Fälle von Subfertilität sind auf männliche Faktoren zurückzuführen, und fast 20 % bis 30 % können ausschließlich auf männliche Faktoren zurückgeführt werden 1,2,3. Infektionen des männlichen Genitaltrakts (MGTIs) stellen eine der Hauptursachen für männliche Unfruchtbarkeit dar und machen etwa 15 % der Fälle aus 4,5.
Die meisten Menschen haben Leukozyten in ihrem Sperma, die 13 % der Nicht-Spermatozoenzellen ausmachen, wobei die unterschiedlichen Anteile 12 % der Neutrophilen, der Makrophagen 0,9 % und der Lymphozyten 0,1 % betragen6,7. Nach dem Laborhandbuch der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für die Untersuchung und Verarbeitung von menschlichem Sperma (5. Auflage) wird Leukozytospermie in der Regel als das Vorhandensein von >1 ×10 6 Zellen/ml Leukozyten im Sperma8 definiert. Dieser Zustand kann durch zahlreiche Faktoren wie Umweltgifte, Drogenmissbrauch, Varikozelen, MGTIs usw. verursacht werden, die alle möglicherweise zu einem abnormalen Anstieg der Leukozytenkonzentration im Sperma führen9. Leukozyten können den Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im Sperma erhöhen, was zu einer Lipidperoxidation und oxidativen Schäden an Protein und DNA führt, was zu einer verminderten Beweglichkeit der Spermien, erhöhten morphologischen Anomalien der Spermien, einem erhöhten DNA-Fragmentierungsindex der Spermien, einer Beeinträchtigung der Spermien-Akrosomfunktion und sogar zu negativen Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung führt10,11.
Derzeit entscheiden sich Andrologen häufig dafür, runde Zellen im Sperma oder Elastase im Samenplasma zu untersuchen, wenn sie eine Entzündung des Genitaltrakts feststellen. Es ist jedoch oft schwierig, abgestreifte spermatogene Zellen und Epithelzellen des Fortpflanzungstrakts zu unterscheiden, die nicht dazu beitragen, den wahllosen und unnötigen Einsatz von Antibiotika zu reduzieren6. Die letztgenannte Untersuchungsmethode ist relativ kompliziert und zeitaufwändig, mit langsamer Ergebnisberichterstattung, was für die Frühdiagnose und Behandlung von Krankheiten wie MGTIs nicht von Vorteil ist. Die American Urological Association (AUA) schlägt vor, dass eine weitere Unterscheidung zwischen Leukozyten und abgestreiften Zellen aus dem Genitaltrakt vorgenommen werden sollte, wenn die Konzentration der runden Zellen in der Samenanalyse größer als 1 × 106 Zellen/mlist 12. Einige Andrologielabore verwenden die Durchflusszytometrie13 oder die Immunzytozytochemie des Leukozytenantigens (z. B. CD45)14 , um Leukozyten zu untersuchen. Diese Methoden sind zwar präzise, aber teuer und zeitaufwändig, was eine großflächige klinische Implementierung erschwert, insbesondere in Entwicklungsländern.
Peroxidase ist in verschiedenen Zelltypen weit verbreitet und spielt eine entscheidende Rolle bei der Resistenz gegen Schäden durch oxidativen Stress. Die Myeloperoxidase (MPO) ist ein Mitglied der Peroxidase-Unterfamilie, die im Allgemeinen in Immunzellen exprimiert wird. Es wird am stärksten in den azurophilen Granula der Neutrophilenexprimiert 15,16 und wird auch in Lymphozyten17,18, Monozyten und Makrophagen19 exprimiert. Die Konzentration von Leukozyten, insbesondere Neutrophilen, im Sperma kann durch die Untersuchung von runden Zellen bestimmt werden, die Peroxidase-positiv sind 7,20. Um den Untersuchungsprozess von Leukozyten im Sperma wirtschaftlich, bequem und effizient zu gestalten, haben wir die Untersuchungsmethode überarbeitet. Mit Hilfe des computergestützten Samenanalysesystems (CASA) kann die Konzentration der Leukozyten innerhalb von 60 Minuten bestimmt werden. Diese neue Methode reduziert die Untersuchungskosten und die Wartezeit der Patienten auf die Ergebnisse, entlastet die Labortechniker und verkürzt die Wartezeit des Arztes auf Diagnose und Behandlung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ortho-Toluidin und Wasserstoffperoxid haben lichtempfindliche Eigenschaften und können sich unter Lichteinwirkung zersetzen. Um die Wirksamkeit der Testreagenzien zu gewährleisten, wird empfohlen, die vorbereitete Arbeitsflüssigkeit an einem dunklen Ort zu lagern.
Samenproben weisen naturgemäß heterogene Merkmale auf. Bei der Vorbereitung von Samenproben sind die korrekte Beurteilung des Verflüssigungszustands des Samens und die gründliche Homogenisierung der Samenproben vor jeder Prob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Andrologie-Labor des Zentrums für Reproduktionsmedizin, dem dritten angeschlossenen Krankenhaus der Sun Yat-sen Universität, für die Bereitstellung der Einrichtungen für diese Studie. Bei der Erstellung dieses Artikels waren keine finanziellen Mittel beteiligt.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
