Summary
En este trabajo se presenta un protocolo económico y eficaz para examinar los leucocitos positivos para peroxidasa en el semen. Con la ayuda de un sistema de análisis de semen asistido por computadora (CASA), la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa en el semen se puede obtener en un total de 60 minutos, mejorando efectivamente la eficiencia del laboratorio de andrología y los andrólogos.
Abstract
La leucocitospermia puede conducir a una disminución de la motilidad de los espermatozoides, un aumento de las anomalías morfológicas de los espermatozoides, un índice elevado de fragmentación del ADN de los espermatozoides, un deterioro de la función del acrosomia de los espermatozoides e incluso afectar el desarrollo embrionario. Es una enfermedad andrológica común en la práctica clínica y una de las causas importantes de infertilidad masculina. Al determinar si existe inflamación del tracto reproductor masculino, los andrólogos a menudo optan por examinar las células redondas o la elastasa plasmática seminal en el semen como base diagnóstica clínica. Sin embargo, el examen de las células redondas es fácilmente influenciado por las células espermatogénicas desprendidas y las células epiteliales del tracto reproductivo, que no contribuyen a reducir el uso indiscriminado e innecesario de antibióticos. Al mismo tiempo, el proceso de detección de la elastasa es relativamente complicado, requiere mucho tiempo y tarda en informar los resultados, lo que no es beneficioso para el diagnóstico y tratamiento tempranos de enfermedades como las infecciones del tracto genital masculino (MGTI). Hemos aplicado de forma innovadora el examen de leucocitos positivos a peroxidasa en semen asistido por un sistema de análisis de semen asistido por ordenador (CASA) como criterio diagnóstico de leucocitospermia, resolviendo con éxito estos problemas. Este examen solo requiere la adición del fluido operativo que consta de cuatro reactivos en la muestra, y el tiempo total de reacción a temperatura ambiente se puede controlar en 20-30 minutos. Con el frotis posterior y el examen microscópico, se puede obtener la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa en el semen en un total de 60 min, lo que puede utilizarse para diagnosticar si existía la inflamación del tracto reproductor masculino.
Introduction
La infertilidad se ha convertido en un problema de salud pública mundial que afecta aproximadamente al 15% de las parejas en edad reproductiva. Los factores masculinos son aportados por alrededor del 50% del total de los casos de subfertilidad, y entre el 20% y el 30% pueden atribuirse únicamente a factores masculinos 1,2,3. Las infecciones del tracto genital masculino (ITMG) constituyen una de las causas significativas de infertilidad masculina, representando alrededor del 15% de los casos 4,5.
La mayoría de los individuos tienen leucocitos en su semen, constituyendo el 13% de las células no espermatozoides, siendo las proporciones diferenciales neutrófilos 12%, macrófagos 0,9% y linfocitos 0,1%6,7. De acuerdo con el manual de laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el examen y procesamiento del semen humano (5ª ed.), la leucocitopsia suele definirse como la presencia de >1 × 106 células/ml de leucocitos en el semen8. Esta afección puede ser causada por numerosos factores, como toxinas ambientales, abuso de sustancias, varicoceles, MGTI, etc., todos los cuales pueden conducir a un aumento anormal de la concentración de leucocitos en el semen9. Los leucocitos pueden elevar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el semen, causando peroxidación lipídica y daño oxidativo a las proteínas y al ADN, lo que resulta en una disminución de la motilidad de los espermatozoides, un aumento de las anomalías morfológicas de los espermatozoides, un índice elevado de fragmentación del ADN de los espermatozoides, un deterioro de la función del acrossoma de los espermatozoides e incluso impactos negativos en el desarrollo embrionario10,11.
En la actualidad, los andrólogos suelen optar por examinar las células redondas del semen o la elastasa del plasma seminal al identificar la inflamación del tracto genital. Sin embargo, a menudo es difícil distinguir las células espermatogénicas desprendidas y las células epiteliales del tracto reproductivo, que no contribuyen a reducir el uso indiscriminado e innecesario de antibióticos6. Este último método de examen es relativamente complicado y requiere mucho tiempo, con un informe lento de los resultados, lo que no es beneficioso para el diagnóstico y tratamiento tempranos de enfermedades como las MGTI. La Asociación Americana de Urología (AUA, por sus siglas en inglés) sugiere una mayor diferenciación entre los leucocitos y las células desprendidas del tracto genital cuando la concentración de células redondas en el análisis de semen es superior a 1 × 106 células/mL12. Algunos laboratorios de andrología utilizan la citometría de flujo13 o la inmunocitoquímica del antígeno leucocitario (por ejemplo, CD45)14 para examinar los leucocitos. Si bien estos métodos son precisos, son costosos y requieren mucho tiempo, lo que dificulta la implementación clínica a gran escala, especialmente en los países en desarrollo.
La peroxidasa está ampliamente distribuida en varios tipos de células y desempeña un papel crucial en la resistencia al daño por estrés oxidativo. La mieloperoxidasa (MPO) es un miembro de la subfamilia de las peroxidasas que generalmente se expresa en las células inmunitarias. Se expresa más en los gránulos azurófilosde los neutrófilos 15,16 y también se expresa en linfocitos17,18, monocitos y macrófagos19. La concentración de leucocitos, especialmente neutrófilos, en el semen puede obtenerse mediante el examen de células redondas que son peroxidasas positivas 7,20. Para que el proceso de examen de leucocitos en semen sea económico, conveniente y eficiente, rediseñamos el método de examen. Con la ayuda del sistema de análisis de semen asistido por ordenador (CASA), se puede obtener la concentración de leucocitos en 60 minutos. Este nuevo método reduce los costos de examen de los pacientes y el tiempo de espera para obtener los resultados, alivia la carga de trabajo de los técnicos de laboratorio y acorta el período de espera del diagnóstico y tratamiento del médico.
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Protocol
Este estudio ha sido revisado y aprobado por el Comité de Ética Médica del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen.
1. Preparación de la solución de trabajo
- Reúna los siguientes reactivos esenciales para preparar la solución de trabajo: solución de sustrato de orto-toluidina, solución saturada de cloruro de amonio (NH4Cl), solución de sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (Na2EDTA) de 148 mmol/L y solución de peróxido de hidrógeno al 6% (v/v). Colóquelos en una mesa de laboratorio a temperatura ambiente (RT) junto con las herramientas necesarias, como pipetas de transferencia (1000 μL, 200 μL, 10 μL) y gradillas para tubos de ensayo.
PRECAUCIÓN: Lea la hoja de datos de seguridad (FDS) antes de manipular los reactivos mencionados anteriormente. - Prepare un frasco de reactivo de color marrón opaco para almacenar y proteger la solución de trabajo preparada de la exposición a la luz.
- Transfiera los reactivos al frasco de reactivo marrón opaco según las proporciones especificadas a continuación:
- Utilice la pipeta de transferencia de 200 μL y ajuste la escala a 100 μL girando la perilla. A continuación, transfiera 100 μl de la solución de NH4Cl al frasco de reactivo marrón opaco.
- Sustituya la punta de la pipeta y transfiera 100 μl de la solución de 148 mmol/L de Na2EDTA al frasco de reactivo marrón opaco utilizando la pipeta de transferencia de 200 μl mencionada anteriormente. Luego, sople suavemente pipeteando y homogeneice completamente la solución.
- Utilice la pipeta de transferencia de 1000 μL y ajuste la escala a 900 μL girando la perilla. A continuación, transfiera 900 μL de la solución de sustrato de orto-toluidina al frasco de reactivo marrón opaco, sople suavemente mediante pipeteo y homogeneice completamente la solución.
- Utilice la pipeta de transferencia de 10 μL y ajuste la escala a 5 μL girando la perilla. A continuación, transfiera 5 μL de la solución de peróxido de hidrógeno al 6% (v/v) a la botella de reactivo marrón opaco.
- Utilice la pipeta de transferencia de 1000 μL y ajuste la escala a 1000 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta, sople suavemente pipeteando y homogeneice completamente la solución en el frasco de reactivo marrón opaco.
- Guarde la solución de trabajo lista para usar en el frasco de reactivo marrón opaco en RT, lejos de la luz. La solución de trabajo es reactiva durante 24 h.
- Cada muestra de semen requiere 900 μL de la solución de trabajo. Asegúrese de que la cantidad de la solución de trabajo preparada cada día corresponda al número de muestras examinadas diariamente.
2. Preparación de la muestra de semen
- Antes de recolectar la muestra de semen, asegúrese de que el paciente se haya abstenido de eyacular durante 2 a 7 días, como lo requiere el manual de laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para examinar y procesar el semen humano (5ª ed.) 8. La masturbación es el método preferido para obtener muestras de semen. Para mejorar la precisión del examen, indique al paciente que recoja todo el semen eyaculado.
- Encienda el soporte de temperatura constante y caliente hasta 37 °C con antelación para que la licuefacción posterior de la muestra de semen pueda realizarse sin problemas.
- Al recibir la muestra de semen del paciente, registre meticulosamente la información detallada, incluido el código de identificación, el tiempo de recolección, la duración de la abstinencia y otra información pertinente, en la pared exterior del receptáculo a base de polímero.
- Coloque el recipiente a base de polímero que alberga la muestra de semen en el soporte de temperatura constante precalentado a 37 °C, lo que es beneficioso para la licuefacción del semen.
- Extraer la muestra de semen en una pipeta a base de polímeros y observar el estado de licuefacción cada 5 min hasta que la muestra de semen esté completamente licuada.
- Si la muestra de semen no se ha licuado completamente en 30 minutos, no realice el examen todavía; Continúe esperando otros 30 minutos. Si el semen aún no está completamente licuado después de 60 minutos, agregue un volumen igual de solución tampón de fosfato para una dilución 1:1 y agite suavemente para promover la licuefacción.
- Después de una agitación minuciosa y una homogeneización constante, conserve la muestra de semen completamente licuada para los procedimientos de examen posteriores.
3. Tinción de los leucocitos positivos para peroxidasa y análisis de la muestra de semen original
- Antes de la toma de muestras, utilice una pipeta a base de polímeros para soplar repetidamente mediante pipeteo y homogeneizar completamente la muestra de semen que se está examinando.
- Utilice la pipeta de transferencia de 200 μL y ajuste la escala a 100 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta y, a continuación, transfiera 100 μl de la muestra de semen a un tubo de centrífuga.
- Utilice la pipeta de transferencia de 1000 μL y ajuste la escala a 900 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta y, a continuación, transfiera 900 μL de la solución de trabajo mencionada anteriormente al tubo de centrífuga.
- Soplar repetidamente mediante pipeteo y homogeneizar completamente el reactivo, que consiste en la muestra de semen y la solución de trabajo, utilizando la pipeta de transferencia de 1000 μL.
- Coloque el tubo de centrífuga en una rejilla de tubos de ensayo sobre un agitador bidimensional y sométalo a agitación continua a 200 rpm durante 30 minutos a RT.
- Mientras espera la reacción de tinción, analice la muestra de semen utilizando el sistema CASA para determinar la concentración de espermatozoides en la muestra de semen original en el receptáculo a base de polímero.
- Encienda el interruptor de encendido del sistema CASA y haga doble clic en el icono SCA SCOPE para abrir el software de la aplicación.
- Antes de tomar muestras, sople repetidamente mediante pipeteo y vuelva a homogeneizar completamente la muestra de semen original con una pipeta a base de polímeros.
- Utilice la pipeta de transferencia de 10 μL y ajuste la escala a 10 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta, pipetee hasta 10 μL de la muestra de semen original y colóquela en la cámara de recuento de SCA. Espere 60 s para que la muestra de semen deje de desplazarse.
- Coloque la cámara de recuento SCA en el portamuestras del sistema CASA y coloque la información del paciente en el cuadro de diálogo del software de aplicación para prepararse para el examen formal.
- Examine la muestra de semen original en la cámara de recuento de SCA con el sistema CASA haciendo clic en el botón Inicio y registre los datos necesarios, como la concentración de espermatozoides.
4. Observación de los leucocitos y espermatozoides positivos a peroxidasa
- Utilice la pipeta de transferencia de 1000 μL y ajuste la escala a 1000 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta, sople repetidamente pipeteando y homogeneice completamente el reactivo, que consiste en una muestra de semen y una solución de trabajo en el tubo de centrífuga nuevamente al final del proceso de reacción de 30 minutos.
- Utilice la pipeta de transferencia de 10 μL y ajuste la escala a 10 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta, pipetee hasta 10 μL del reactivo mencionado anteriormente y colóquelo en la cámara de recuento de espermatozoides. Por último, cubra la cámara de recuento de espermatozoides con un cubreobjetos de vidrio específico.
- Coloque la cámara de recuento de espermatozoides en la platina microscópica y encienda el interruptor de encendido del microscopio óptico con dos oculares de 10x. A continuación, espere 60 s para que la muestra de reactivo deje de desplazarse.
- Cambie el convertidor microscópico a la lente del objetivo de 10x durante el tiempo de espera. A continuación, ajuste la perilla de ajuste grueso y la perilla de ajuste fino en secuencia. Por último, observe los espermatozoides y las células redondas con un aumento de 10×10.
- Cambie el convertidor microscópico a la lente del objetivo de 40x después de determinar el campo de visión que se va a analizar, y observe los espermatozoides y los leucocitos marrones positivos a peroxidasa con un aumento de 10 × 40.
- Utilice el sistema de contador electrónico para contar al menos 200 espermatozoides y el número de leucocitos marrones positivos para peroxidasa dentro de los campos correspondientes.
5. Cálculo de la concentración de leucocitos peroxidasa positivos
- Calcule la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa mediante la siguiente fórmula:
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Representative Results
Al implementar el procedimiento antes mencionado, el reactivo en el tubo de centrífuga con frecuencia manifiesta una apariencia subtranslúcida y opalescente (Figura 1). La detección de un color marrón evidente revela una posible degranulación de los leucocitos, lo que puede dar lugar a la tinción de líquidos. En consecuencia, el proceso de tinción podría fallar, lo que haría necesario volver a teñir o recolectar una nueva muestra de semen para volver a analizar21.
Los leucocitos positivos para peroxidasa mostraron un tono marrón, que contrasta con las células redondas ordinarias no teñidas (Figura 2, diapositiva ordinaria). Posteriormente, se contaron todos los espermatozoides y leucocitos marrones bajo el campo microscópico actual antes de cambiar a un campo completamente nuevo para la observación y el recuento continuos. Para garantizar una precisión óptima, es necesario contar un mínimo de 200 espermatozoides y los leucocitos presentes en el campo de visión correspondiente.
Figura 1: Solución reactiva. El reactivo que completa el proceso de reacción es un líquido opalescente subtranslúcido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Observación bajo microscopio óptico (portaobjetos ordinarios). (A) Leucocitos peroxidasa positivos y (B) células redondas ordinarias observadas en un microscopio óptico de 10 x 40 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La ortotoluidina y el peróxido de hidrógeno tienen propiedades fotosensibles y pueden descomponerse cuando se exponen a la luz. Para garantizar la eficacia de los reactivos de prueba, se recomienda que el fluido de trabajo preparado se almacene en un lugar oscuro.
Las muestras de semen presentan naturalmente características heterogéneas. En el proceso de preparación de muestras de semen, juzgar correctamente el estado de licuefacción del semen y homogeneizar a fondo las muestras de semen antes de cada muestreo son cruciales para mejorar la fiabilidad de los resultados de las pruebas. Las muestras de semen se licúan completamente en 15 minutos. Se debe considerar la homogeneización mecánica o la digestión enzimática si no se han licuado completamente después de 60 min. Se pueden obtener muestras de semen más homogéneas agitando suavemente el recipiente de la muestra de forma continua durante el proceso de licuefacción utilizando un agitador bidimensional8.
El método de examen presentado en este artículo posee las ventajas de simplicidad, rapidez y rentabilidad. Sin embargo, puede no ser ventajoso en determinadas circunstancias: la peroxidasa se almacena en gránulos azurófilos que serán secretados en el espacio intercelular a través de la degranulación o citopenpsis tras la activación21,22. En consecuencia, los neutrófilos pueden no teñirse y no pueden ser identificados. En tales casos, es necesario repetir el proceso de tinción o incluso exigir al paciente que proporcione una nueva muestra de semen para volver a examinarla. Para minimizar esta situación, se recomienda utilizar muestras de semen fresco siempre que sea posible con un tiempo de colocación mínimo y un proceso de homogeneización suave. Este método solo puede identificar enfermedades activas o infecciones y no puede identificar enfermedades en etapas posteriores, como infecciones crónicas16. Además, otros tipos de leucocitos con menor contenido de peroxidasa, como linfocitos, macrófagos y monocitos, presentan dificultades para la tinción con este método; por lo tanto, se pueden lograr resultados confiables mediante el empleo de tinción inmunohistoquímica del antígeno leucocitario (por ejemplo, CD45).
Tal y como exige la 5ª edición del manual de la OMS, la tinción tradicional de mieloperoxidasa positiva (prueba de Endtz) requiere el recuento microscópico de al menos 200 leucocitos positivos para peroxidasa en una placa de recuento de células sanguíneas para calcular su concentración8. En comparación con la prueba manual tradicional de Endtz, este protocolo introduce los datos de concentración de espermatozoides obtenidos por detección CASA, combinando métodos manuales y automáticos. Para calcular la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa, se contaron al menos 200 espermatozoides y leucocitos en el campo de visión correspondiente bajo un microscopio. Dado que la concentración de espermatozoides en el semen es mucho mayor que la de los leucocitos, se requirió menos tiempo para contar 200 espermatozoides en comparación con el recuento de 200 leucocitos positivos para peroxidasa.
Los pacientes con oligospermia, criptozoospermia y azoospermia graves a menudo enfrentan desafíos para contar un número suficiente de espermatozoides. En tales casos, la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa se puede calcular directamente utilizando una placa de recuento de células sanguíneas como se describe en el manual de la placa. Además, para los pacientes que no requieren CASA o laboratorios sin equipo CASA, también se puede utilizar una placa de recuento de células sanguíneas para determinar la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Laboratorio de Andrología del Centro de Medicina Reproductiva, el Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen, por proporcionar las instalaciones para este estudio. En la preparación de este artículo no se utilizó ningún tipo de financiación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
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