Examen de leucocitos positivos para peroxidasa en el semen
Summary
En este trabajo se presenta un protocolo económico y eficaz para examinar los leucocitos positivos para peroxidasa en el semen. Con la ayuda de un sistema de análisis de semen asistido por computadora (CASA), la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa en el semen se puede obtener en un total de 60 minutos, mejorando efectivamente la eficiencia del laboratorio de andrología y los andrólogos.
Abstract
La leucocitospermia puede conducir a una disminución de la motilidad de los espermatozoides, un aumento de las anomalías morfológicas de los espermatozoides, un índice elevado de fragmentación del ADN de los espermatozoides, un deterioro de la función del acrosomia de los espermatozoides e incluso afectar el desarrollo embrionario. Es una enfermedad andrológica común en la práctica clínica y una de las causas importantes de infertilidad masculina. Al determinar si existe inflamación del tracto reproductor masculino, los andrólogos a menudo optan por examinar las células redondas o la elastasa plasmática seminal en el semen como base diagnóstica clínica. Sin embargo, el examen de las células redondas es fácilmente influenciado por las células espermatogénicas desprendidas y las células epiteliales del tracto reproductivo, que no contribuyen a reducir el uso indiscriminado e innecesario de antibióticos. Al mismo tiempo, el proceso de detección de la elastasa es relativamente complicado, requiere mucho tiempo y tarda en informar los resultados, lo que no es beneficioso para el diagnóstico y tratamiento tempranos de enfermedades como las infecciones del tracto genital masculino (MGTI). Hemos aplicado de forma innovadora el examen de leucocitos positivos a peroxidasa en semen asistido por un sistema de análisis de semen asistido por ordenador (CASA) como criterio diagnóstico de leucocitospermia, resolviendo con éxito estos problemas. Este examen solo requiere la adición del fluido operativo que consta de cuatro reactivos en la muestra, y el tiempo total de reacción a temperatura ambiente se puede controlar en 20-30 minutos. Con el frotis posterior y el examen microscópico, se puede obtener la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa en el semen en un total de 60 min, lo que puede utilizarse para diagnosticar si existía la inflamación del tracto reproductor masculino.
Introduction
La infertilidad se ha convertido en un problema de salud pública mundial que afecta aproximadamente al 15% de las parejas en edad reproductiva. Los factores masculinos son aportados por alrededor del 50% del total de los casos de subfertilidad, y entre el 20% y el 30% pueden atribuirse únicamente a factores masculinos 1,2,3. Las infecciones del tracto genital masculino (ITMG) constituyen una de las causas significativas de infertilidad masculina, representando alrededor del 15% de los casos 4,5.
La mayoría de los individuos tienen leucocitos en su semen, constituyendo el 13% de las células no espermatozoides, siendo las proporciones diferenciales neutrófilos 12%, macrófagos 0,9% y linfocitos 0,1%6,7. De acuerdo con el manual de laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el examen y procesamiento del semen humano (5ª ed.), la leucocitopsia suele definirse como la presencia de >1 × 106 células/ml de leucocitos en el semen8. Esta afección puede ser causada por numerosos factores, como toxinas ambientales, abuso de sustancias, varicoceles, MGTI, etc., todos los cuales pueden conducir a un aumento anormal de la concentración de leucocitos en el semen9. Los leucocitos pueden elevar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el semen, causando peroxidación lipídica y daño oxidativo a las proteínas y al ADN, lo que resulta en una disminución de la motilidad de los espermatozoides, un aumento de las anomalías morfológicas de los espermatozoides, un índice elevado de fragmentación del ADN de los espermatozoides, un deterioro de la función del acrossoma de los espermatozoides e incluso impactos negativos en el desarrollo embrionario10,11.
En la actualidad, los andrólogos suelen optar por examinar las células redondas del semen o la elastasa del plasma seminal al identificar la inflamación del tracto genital. Sin embargo, a menudo es difícil distinguir las células espermatogénicas desprendidas y las células epiteliales del tracto reproductivo, que no contribuyen a reducir el uso indiscriminado e innecesario de antibióticos6. Este último método de examen es relativamente complicado y requiere mucho tiempo, con un informe lento de los resultados, lo que no es beneficioso para el diagnóstico y tratamiento tempranos de enfermedades como las MGTI. La Asociación Americana de Urología (AUA, por sus siglas en inglés) sugiere una mayor diferenciación entre los leucocitos y las células desprendidas del tracto genital cuando la concentración de células redondas en el análisis de semen es superior a 1 × 106 células/mL12. Algunos laboratorios de andrología utilizan la citometría de flujo13 o la inmunocitoquímica del antígeno leucocitario (por ejemplo, CD45)14 para examinar los leucocitos. Si bien estos métodos son precisos, son costosos y requieren mucho tiempo, lo que dificulta la implementación clínica a gran escala, especialmente en los países en desarrollo.
La peroxidasa está ampliamente distribuida en varios tipos de células y desempeña un papel crucial en la resistencia al daño por estrés oxidativo. La mieloperoxidasa (MPO) es un miembro de la subfamilia de las peroxidasas que generalmente se expresa en las células inmunitarias. Se expresa más en los gránulos azurófilosde los neutrófilos 15,16 y también se expresa en linfocitos17,18, monocitos y macrófagos19. La concentración de leucocitos, especialmente neutrófilos, en el semen puede obtenerse mediante el examen de células redondas que son peroxidasas positivas 7,20. Para que el proceso de examen de leucocitos en semen sea económico, conveniente y eficiente, rediseñamos el método de examen. Con la ayuda del sistema de análisis de semen asistido por ordenador (CASA), se puede obtener la concentración de leucocitos en 60 minutos. Este nuevo método reduce los costos de examen de los pacientes y el tiempo de espera para obtener los resultados, alivia la carga de trabajo de los técnicos de laboratorio y acorta el período de espera del diagnóstico y tratamiento del médico.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ortotoluidina y el peróxido de hidrógeno tienen propiedades fotosensibles y pueden descomponerse cuando se exponen a la luz. Para garantizar la eficacia de los reactivos de prueba, se recomienda que el fluido de trabajo preparado se almacene en un lugar oscuro.
Las muestras de semen presentan naturalmente características heterogéneas. En el proceso de preparación de muestras de semen, juzgar correctamente el estado de licuefacción del semen y homogeneizar a fondo las muestras de seme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Laboratorio de Andrología del Centro de Medicina Reproductiva, el Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen, por proporcionar las instalaciones para este estudio. En la preparación de este artículo no se utilizó ningún tipo de financiación.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
