Summary
Dette papiret presenterer en økonomisk og effektiv protokoll for å undersøke peroksidase-positive leukocytter i sæd. Ved hjelp av et dataassistert sædanalysesystem (CASA) kan konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter i sæd oppnås innen totalt 60 minutter, noe som effektivt forbedrer effektiviteten til andrologisk laboratorium og androloger.
Abstract
Leukocytospermi kan føre til redusert spermatozoa motilitet, økte spermatozoa morfologiske abnormiteter, forhøyet spermatozoa DNA-fragmenteringsindeks, svekkelse av spermatozoa akrosomfunksjonen, og til og med påvirket embryonal utvikling. Det er en vanlig andrologisk sykdom i klinisk praksis og en av de viktigste årsakene til mannlig infertilitet. Ved å avgjøre om mannlig reproduksjonstarmbetennelse eksisterer, velger androloger ofte å undersøke runde celler eller seminal plasmaelastase i sæden som et klinisk diagnostisk grunnlag. Imidlertid er undersøkelsen av runde celler lett påvirket av sloughed spermatogene celler og epitelceller i reproduktive kanaler, som ikke bidrar til å redusere ukritisk og unødvendig bruk av antibiotika. Samtidig er deteksjonsprosessen av elastase relativt komplisert, tidkrevende og langsom i rapportering av resultater, noe som ikke er gunstig for tidlig diagnose og behandling av sykdommer som mannlige kjønnsorganinfeksjoner (MGTI). Vi har innovativt anvendt undersøkelsen av peroksidase-positive leukocytter i sæd assistert av et dataassistert sædanalysesystem (CASA) som et diagnostisk kriterium for leukocytospermi, og vellykket løsning av disse problemene. Denne undersøkelsen krever bare tilsetning av driftsvæsken bestående av fire reagenser i prøven, og den totale reaksjonstiden ved romtemperatur kan styres innen 20-30 minutter. Ved den etterfølgende smøring og mikroskopisk undersøkelse kan konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter i sæd oppnås innen totalt 60 minutter, som kan brukes til å diagnostisere om betennelsen i den mannlige reproduktive kanalen eksisterte.
Introduction
Infertilitet har dukket opp som et globalt folkehelseproblem som påvirker omtrent 15% av parene i deres reproduktive alder. Mannlige faktorer bidrar med rundt 50% av de totale subfertilitetstilfellene, og nesten 20% til 30% kan tilskrives utelukkende mannlige faktorer 1,2,3. Mannlige kjønnsorganinfeksjoner (MGTI) utgjør en av de viktigste årsakene til mannlig infertilitet, og står for ca 15% av tilfellene 4,5.
De fleste individer har leukocytter i sæden, som utgjør 13% av ikke-spermatozoanceller, med differensielle proporsjoner som nøytrofiler 12%, makrofager 0,9% og lymfocytter 0,1%6,7. Ifølge Verdens helseorganisasjons (WHO) laboratoriehåndbok for undersøkelse og behandling av human sæd (5. utg.), er leukocytospermi vanligvis definert som tilstedeværelse av >1 × 106 celler / ml leukocytter i sæd8. Denne tilstanden kan skyldes mange faktorer som miljøgifter, stoffmisbruk, varicoceles, MGTI, etc., som alle potensielt fører til en unormal økning i leukocyttkonsentrasjonen i sæd9. Leukocytter kan heve nivået av reaktive oksygenarter (ROS) i sæd, forårsaker lipidperoksydasjon og oksidativ skade på protein og DNA, noe som resulterer i redusert spermatozoa-motilitet, økte morfologiske abnormiteter i spermatozoa, forhøyede spermatozoer DNA-fragmenteringsindeks, svekkelse av spermatozoa-akrosomfunksjonen, og til og med negative virkninger på embryoutvikling10,11.
For tiden velger androloger ofte å undersøke runde celler i sæd eller elastase i sædplasma når de identifiserer betennelse i kjønnsorganene. Imidlertid er det ofte utfordrende å skille sloughed spermatogene celler og epitelceller i reproduktive kanaler, som ikke bidrar til å redusere ukritisk og unødvendig bruk av antibiotika6. Sistnevnte undersøkelsesmetode er relativt komplisert og tidkrevende, med langsom resultatrapportering, noe som ikke er gunstig for tidlig diagnose og behandling av sykdommer som MGTI. American Urological Association (AUA) foreslår ytterligere differensiering mellom leukocytter og sloughed celler fra kjønnsorganet bør gjøres når den runde cellekonsentrasjonen i sædanalyse er større enn 1 × 106 celler / ml12. Noen andrologilaboratorier bruker flowcytometri13 eller leukocyttantigen (f.eks. CD45) immunocytokjemi14 for å undersøke leukocytter. Selv om disse metodene er presise, er de dyre og tidkrevende, noe som gjør klinisk implementering i stor skala vanskelig, spesielt i utviklingsland.
Peroksidase er utbredt i ulike typer celler og spiller en avgjørende rolle i motstanden mot oksidativ stressskade. Myeloperoksidase (MPO) er medlem av peroksidase-underfamilien som vanligvis uttrykkes i immunceller. Det uttrykkes mest i nøytrofilenes azurofile granulater15,16 og uttrykkes også i lymfocytter17,18, monocytter og makrofager19. Konsentrasjonen av leukocytter, spesielt nøytrofiler, i sæd kan oppnås ved å undersøke runde celler som er peroksidase-positive 7,20. For å gjøre undersøkelsesprosessen av leukocytter i sæd økonomisk, praktisk og effektiv, reengineered vi undersøkelsesmetoden. Assistert av CASA-systemet (Computer-Assisted Semen Analysis), kan konsentrasjonen av leukocytter oppnås innen 60 minutter. Denne nye metoden reduserer pasientenes undersøkelseskostnader og ventetid for å oppnå resultater, letter arbeidsbelastningen til laboratorieteknikere og forkorter legens diagnose og behandlingstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien er gjennomgått og godkjent av Medical Ethics Committee of The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University.
1. Forberedelse av arbeidsløsningen
- Samle følgende reagenser som er essensielle for fremstilling av arbeidsløsningen - orto-toluidinsubstratløsning, mettet ammoniumklorid (NH4Cl) løsning, 148 mmol / L etylendiamintetraeddiksyre dinatriumsalt (Na2EDTA) løsning og 6% (v / v) hydrogenperoksidoppløsning. Plasser dem på en romtemperert (RT) labbenk sammen med nødvendig verktøy, for eksempel overføringspipetter (1000 μL, 200 μL, 10 μL) og reagensrørstativer.
FORSIKTIG: Les sikkerhetsdatabladet (SDS) før du håndterer de ovennevnte reagensene. - Forbered en ugjennomsiktig brun reagensflaske for å lagre og beskytte den forberedte arbeidsløsningen mot eksponering for lys.
- Overfør reagensene til den ugjennomsiktige brune reagensflasken i henhold til proporsjonene som er angitt nedenfor:
- Bruk overføringspipetten på 200 μL og juster skalaen til 100 μL ved å vri på knappen. Deretter overføres 100 μL av NH4Cl-oppløsningen til den ugjennomsiktige brune reagensflasken.
- Sett pipettespissen på plass og overfør 100 mikrol av 148 mmol/lNa2EDTA-oppløsningen til den ugjennomsiktige brune reagensflasken ved bruk av 200 μL overføringspipetten nevnt ovenfor. Deretter blåser du forsiktig ved pipettering og homogeniserer løsningen grundig.
- Bruk overføringspipetten på 1000 μL og juster skalaen til 900 μL ved å vri på knappen. Deretter overfører 900 μL av orto-toluidinsubstratoppløsningen til den ugjennomsiktige brune reagensflasken, blåser forsiktig ved pipettering og homogeniser oppløsningen grundig.
- Bruk overføringspipetten på 10 μL og juster skalaen til 5 μL ved å vri på knappen. Deretter overføres 5 μL av 6% (v / v) hydrogenperoksidoppløsningen til den ugjennomsiktige brune reagensflasken.
- Bruk overføringspipetten på 1000 μL og juster skalaen til 1000 μL ved å vri på knappen. Sett pipettespissen på plass, blås forsiktig med pipettering og homogeniser oppløsningen grundig i den ugjennomsiktige brune reagensflasken.
- Oppbevar den bruksklare arbeidsløsningen i den ugjennomsiktige brune reagensflasken på RT, borte fra lys. Arbeidsløsningen er reaktiv i 24 timer.
- Hver sædprøve krever 900 μL av arbeidsløsningen. Sørg for at mengden av arbeidsløsningen som utarbeides hver dag, tilsvarer antall prøver som undersøkes daglig.
2. Fremstilling av sædprøve
- Før du samler sædprøven, må du sørge for at pasienten har avstått fra utløsning i 2 til 7 dager som kreves av Verdens helseorganisasjon (WHO) laboratoriehåndbok for undersøkelse og behandling av menneskelig sæd (5. utg.) 8. Onani er den foretrukne metoden for å ta sædprøver. For å forbedre nøyaktigheten av undersøkelsen, instruer pasienten om å samle all utløst sæd.
- Slå på konstant temperaturstativ og varm opp til 37 °C på forhånd, slik at den påfølgende flytendegjøringen av sædprøven kan gå jevnt.
- Ved mottak av pasientens sædprøve, registrer detaljert informasjon, inkludert identifikasjonskode, innsamlingstid, avholdenhetsvarighet og annen relevant informasjon, på ytterveggen av polymerbasert beholder.
- Plasser den polymerbaserte beholderen som inneholder sædprøven på det konstante temperaturstativet forvarmet til 37 ° C, noe som er gunstig for sædflytendegjøringen.
- Trekk sædprøven inn i en polymerbasert pipette og observer tilstanden for flytendegjøring hvert 5. minutt til sædprøven er fullstendig flytende.
- Hvis sædprøven ikke er fullstendig flytende innen 30 minutter, må du ikke utføre undersøkelsen ennå; Fortsett å vente i ytterligere 30 minutter. Hvis sæden fortsatt ikke er fullstendig flytende etter 60 minutter, tilsett et likt volum fosfatbufferløsning for en 1:1-fortynning og rør forsiktig for å fremme flytendegjøring.
- Etter grundig omrøring og konsekvent homogenisering, behold den fullstendig flytende sædprøven for de påfølgende undersøkelsesprosedyrene.
3. Farging av peroksidase-positive leukocytter og analyse av den opprinnelige sædprøven
- Før prøvetaking, bruk en polymerbasert pipette til å blåse gjentatte ganger ved pipettering og grundig homogenisere sædprøven som undersøkes.
- Bruk overføringspipetten på 200 μL og juster skalaen til 100 μL ved å vri på knappen. Sett pipettespissen på plass, og overfør deretter 100 μL av sædprøven til et sentrifugerør.
- Bruk overføringspipetten på 1000 μL og juster skalaen til 900 μL ved å vri på knappen. Sett pipettespissen på plass, og overfør deretter 900 μL av ovennevnte arbeidsløsning til sentrifugerøret.
- Blås gjentatte ganger ved pipettering og homogeniser reaktanten grundig, som består av sædprøven og arbeidsløsningen, ved bruk av 1000 μL overføringspipetten.
- Plasser sentrifugerøret i et reagensrørstativ på en todimensjonal shaker og utsett den for kontinuerlig omrøring ved 200 o / min i 30 minutter ved RT.
- Mens du venter på fargereaksjonen, analyser sædprøven ved hjelp av CASA-systemet for å bestemme konsentrasjonen av spermatozoer i den opprinnelige sædprøven i den polymerbaserte beholderen.
- Slå på strømbryteren til CASA-systemet og dobbeltklikk på SCA SCOPE-ikonet for å åpne programvaren.
- Før prøvetaking, blås gjentatte ganger ved pipettering og homogeniser den opprinnelige sædprøven grundig igjen med en polymerbasert pipette.
- Bruk overføringspipetten på 10 μL og juster skalaen til 10 μL ved å vri på knappen. Sett på pipettespissen, pipetter opp 10 μL av den opprinnelige sædprøven, og plasser den i SCA-tellekammeret. Vent i 60 s til sædprøven slutter å drive.
- Plasser SCA-tellekammeret på prøveholderen til CASA-systemet og angi pasientens informasjon i dialogboksen til applikasjonsprogramvaren for å forberede den formelle undersøkelsen.
- Undersøk den opprinnelige sædprøven i SCA-tellekammeret med CASA-systemet ved å klikke på Start-knappen og registrer de nødvendige dataene, for eksempel konsentrasjonen av spermatozoer.
4. Observasjon av peroksidase-positive leukocytter og spermatozoer
- Bruk overføringspipetten på 1000 μL og juster skalaen til 1000 μL ved å vri på knappen. Bytt pipettespissen, blås deretter gjentatte ganger ved pipettering og homogeniser reaktanten grundig, som består av sædprøve og arbeidsløsning i sentrifugerøret igjen ved slutten av 30 minutters reaksjonsprosess.
- Bruk overføringspipetten på 10 μL og juster skalaen til 10 μL ved å vri på knappen. Sett på pipettespissen, pipett opp 10 μL av reaktanten nevnt ovenfor, og plasser den i sædtellekammeret. Til slutt, dekk sædtellekammeret med et dedikert glassdeksel.
- Plasser sædtellekammeret på det mikroskopiske stadiet og slå på strømbryteren til det optiske mikroskopet med to 10x okularer. Vent deretter i 60 s for at reaktantprøven slutter å drive.
- Bytt mikroskopisk omformer til 10x objektivlinsen i ventetiden. Juster deretter den grove justeringsknappen og finjusteringsknappen i rekkefølge. Til slutt observerer du spermatozoa og runde celler under en forstørrelse på 10×10.
- Bytt den mikroskopiske omformeren til 40x objektivlinsen etter å ha bestemt synsfeltet som skal analyseres, og observer spermatozoa og brune peroksidase-positive leukocytter under en forstørrelse på 10 × 40.
- Bruk det elektroniske tellersystemet til å telle minst 200 spermatozoer og antall brune peroksidase-positive leukocytter innenfor de tilsvarende feltene.
5. Beregning av konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter
- Beregn konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter ved å bruke følgende formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved implementering av den nevnte prosedyren manifesterer reaktanten i sentrifugerøret ofte et subtransluent, opaliserende utseende (figur 1). Påvisning av en åpenbart brun farge avslører potensiell degranulering av leukocytter, noe som kan føre til flytende farging. Følgelig kan fargeprosessen mislykkes, noe som gjør det nødvendig å enten beise på nytt eller samle en ny sædprøve for ny testing21.
Peroksidasepositive leukocytter viste en brun nyanse, i kontrast til de ufargede vanlige runde cellene (figur 2, vanlig lysbilde). Deretter ble hver spermatozon og brun leukocytt under det nåværende mikroskopfeltet talt før de skiftet til et helt nytt felt for kontinuerlig observasjon og opptelling. For å sikre optimal nøyaktighet er det nødvendig å telle minst 200 spermatozoer og leukocytter som er tilstede i det tilsvarende synsfeltet.
Figur 1: Reaktantoppløsning. Reaktanten som fullfører reaksjonsprosessen er en subtranslucent opaliserende væske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Observasjon under optisk mikroskop (vanlig lysbilde). (A) Peroksidase-positiv leukocytt og (B) vanlig rund celle observert ved 10 x 40 forstørrelse optisk mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orto-toluidin og hydrogenperoksid har lysfølsomme egenskaper og kan brytes ned når de utsettes for lys. For å sikre effektiviteten av testreagensene, anbefales det at det forberedte arbeidsfluidet lagres på et mørkt sted.
Sædprøver viser naturlig heterogene egenskaper. I fremstillingsprosessen av sædprøver er korrekt bedømmelse av flytendegjøringstilstanden til sæd og grundig homogenisering av sædprøvene før hver prøvetaking avgjørende for å forbedre påliteligheten av testresultatene. Sædprøver fortynnes helt innen 15 min. Mekanisk homogenisering eller enzymatisk fordøyelse bør vurderes hvis de ikke er helt flytende etter 60 minutter. Mer homogene sædprøver kan oppnås ved å riste prøvebeholderen forsiktig kontinuerlig under flytendegjøringsprosessen ved hjelp av en todimensjonal shaker8.
Undersøkelsesmetoden som presenteres i dette papiret, har fordelene med enkelhet, hastighet og kostnadseffektivitet. Det kan imidlertid ikke være fordelaktig under visse omstendigheter: peroksidase lagres i azurofile granulater som vil bli utskilt i det intercellulære rommet gjennom degranulering eller cytopempsis ved aktivering21,22. Følgelig kan nøytrofiler ikke flekke og kan ikke identifiseres. I slike tilfeller blir det nødvendig å gjenta fargeprosessen eller til og med kreve at pasienten gir en ny sædprøve for ny undersøkelse. For å minimere denne situasjonen anbefales det å bruke ferske sædprøver når det er mulig med minimal plasseringstid og en skånsom homogeniseringsprosess. Denne metoden kan bare identifisere aktive sykdommer eller infeksjoner og kan ikke identifisere sykdommer i senere stadier, for eksempel kroniske infeksjoner16. I tillegg utgjør andre typer leukocytter med lavere peroksidaseinnhold, som lymfocytter, makrofager og monocytter, vanskeligheter med farging ved hjelp av denne metoden; Derfor kan oppnå pålitelige resultater ved å bruke leukocyttantigen (f.eks. CD45) immunhistokjemisk farging.
Som påkrevd av den 5. utgaven av WHO-manualen, krever tradisjonell positiv myeloperoksidasefarging (Endtz-test) mikroskopisk telling av minst 200 peroksidase-positive leukocytter i en blodcelletallplate for å beregne konsentrasjonen8. Sammenlignet med den tradisjonelle manuelle Endtz-testen, introduserer denne protokollen spermatozoa-konsentrasjonsdataene oppnådd ved CASA-deteksjon, og kombinerer manuelle og automatiske metoder. For å beregne konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter ble minst 200 spermatozoer og leukocytter i det tilsvarende synsfeltet regnet under et mikroskop. Siden konsentrasjonen av spermatozoa i sæd er mye større enn for leukocytter, var det nødvendig med mindre tid for å telle 200 spermatozoer sammenlignet med å telle 200 peroksidase-positive leukocytter.
Pasienter med alvorlig oligospermi, kryptozoospermi og azoospermi møter ofte utfordringer med å telle et tilstrekkelig antall spermatozoer. I slike tilfeller kan konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter beregnes direkte ved hjelp av en blodcelletellingsplate som beskrevet i håndboken for platen. I tillegg, for pasienter som ikke trenger CASA eller laboratorier uten CASA-utstyr, kan en blodcelletellingsplate også brukes til å bestemme konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for Andrology Laboratory ved Center for Reproductive Medicine, det tredje tilknyttede sykehuset i Sun Yat-sen University, for å gi fasilitetene til denne studien. Ingen finansiering var involvert i utarbeidelsen av denne artikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L.
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J.
