Summary

فحص الكريات البيض إيجابية البيروكسيديز في السائل المنوي

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

تقدم هذه الورقة بروتوكولا اقتصاديا وفعالا لفحص الكريات البيض الإيجابية للبيروكسيديز في السائل المنوي. بمساعدة نظام تحليل السائل المنوي بمساعدة الكمبيوتر (CASA) ، يمكن الحصول على تركيز الكريات البيض الإيجابية للبيروكسيديز في السائل المنوي في غضون 60 دقيقة ، مما يحسن بشكل فعال كفاءة مختبر أمراض الذكورة وأخصائيي أمراض الذكورة.

Abstract

يمكن أن تؤدي زيادة عدد الكريات البيض إلى انخفاض حركة المنوية ، وزيادة التشوهات المورفولوجية للحيوانات المنوية ، وارتفاع مؤشر تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية ، وضعف وظيفة الجسم القمي للحيوانات المنوية ، وحتى التأثير على التطور الجنيني. وهو مرض ذكوري شائع في الممارسة السريرية وأحد الأسباب المهمة للعقم عند الذكور. عند تحديد ما إذا كان التهاب الجهاز التناسلي الذكري موجودا ، غالبا ما يختار أخصائيو الذكورة فحص الخلايا المستديرة أو إيلاستاز البلازما المنوية في السائل المنوي كأساس تشخيصي سريري. ومع ذلك ، فإن فحص الخلايا المستديرة يتأثر بسهولة بالخلايا المنوية المولدة للحيوانات المنوية والخلايا الظهارية في الجهاز التناسلي ، والتي لا تساهم في الحد من الاستخدام العشوائي وغير الضروري للمضادات الحيوية. في الوقت نفسه ، فإن عملية الكشف عن الإيلاستاز معقدة نسبيا ، وتستغرق وقتا طويلا ، وبطيئة في الإبلاغ عن النتائج ، وهو أمر غير مفيد للتشخيص المبكر وعلاج أمراض مثل التهابات الجهاز التناسلي الذكري (MGTIs). لقد طبقنا بشكل مبتكر فحص الكريات البيض إيجابية البيروكسيديز في السائل المنوي بمساعدة نظام تحليل السائل المنوي بمساعدة الكمبيوتر (CASA) كمعيار تشخيصي ل leukocytospermia ، وحل هذه المشاكل بنجاح. يتطلب هذا الفحص فقط إضافة سائل التشغيل المكون من أربعة كواشف إلى العينة ، ويمكن التحكم في إجمالي وقت التفاعل في درجة حرارة الغرفة في غضون 20-30 دقيقة. مع اللطاخة اللاحقة والفحص المجهري ، يمكن الحصول على تركيز الكريات البيض إيجابية البيروكسيديز في السائل المنوي في غضون 60 دقيقة ، والتي يمكن استخدامها لتشخيص ما إذا كان التهاب الجهاز التناسلي الذكري موجودا.

Introduction

برز العقم كقضية صحية عامة عالمية تؤثر على حوالي 15٪ من الأزواج في سن الإنجاب. تساهم العوامل الذكورية بحوالي 50٪ من إجمالي حالات ضعف الخصوبة ، ويمكن أن يعزى ما يقرب من 20٪ إلى 30٪ فقط إلى العوامل الذكورية1،2،3. تشكل التهابات الجهاز التناسلي الذكري (MGTIs) أحد الأسباب المهمة للعقم عند الذكور ، حيث تمثل حوالي 15٪ من الحالات 4,5.

معظم الأفراد لديهم كريات الدم البيضاء في السائل المنوي ، والتي تشكل 13 ٪ من الخلايا غير المنوية ، مع نسب تفاضلية هي العدلات 12 ٪ ، الضامة 0.9 ٪ ، والخلايا الليمفاوية 0.1 ٪ 6،7. وفقا لدليل مختبر منظمة الصحة العالمية (WHO) لفحص ومعالجة السائل المنوي البشري (الطبعة الخامسة) ، عادة ما يتم تعريف الكريات البيض على أنه وجود >1 × 106 خلايا / مل كريات الدم البيضاء في السائل المنوي8. يمكن أن تحدث هذه الحالة بسبب العديد من العوامل مثل السموم البيئية ، وتعاطي المخدرات ، ودوالي الخصية ، و MGTIs ، وما إلى ذلك ، وكلها قد تؤدي إلى زيادة غير طبيعية في تركيز الكريات البيض في السائل المنوي9. يمكن أن ترفع الكريات البيض مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في السائل المنوي ، مما يتسبب في بيروكسيد الدهون والضرر التأكسدي للبروتين والحمض النووي ، مما يؤدي إلى انخفاض حركة الحيوانات المنوية ، وزيادة التشوهات المورفولوجية للحيوانات المنوية ، وارتفاع مؤشر تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية ، وضعف وظيفة الحيوانات المنوية القمي ، وحتى الآثار السلبية على نمو الجنين10،11.

حاليا ، يختار أخصائيو الذكورة عادة فحص الخلايا المستديرة في السائل المنوي أو الإيلاستاز في البلازما المنوية عند تحديد التهاب الجهاز التناسلي. ومع ذلك ، غالبا ما يكون من الصعب التمييز بين الخلايا المنوية المتدهورة والخلايا الظهارية في الجهاز التناسلي ، والتي لا تساهم في تقليل الاستخدام العشوائي وغير الضروري للمضادات الحيوية6. طريقة الفحص الأخيرة معقدة نسبيا وتستغرق وقتا طويلا ، مع بطء الإبلاغ عن النتائج ، وهو أمر غير مفيد للتشخيص والعلاج المبكر لأمراض مثل MGTIs. تقترح الجمعية الأمريكية لجراحة المسالك البولية (AUA) مزيدا من التمييز بين كريات الدم البيضاء والخلايا المقطوعة من الجهاز التناسلي عندما يكون تركيز الخلايا المستديرة في تحليل السائل المنوي أكبر من 1 × 106 خلايا / مل12. تستخدم بعض مختبرات أمراض الذكورة قياس التدفق الخلوي13 أو مستضد الكريات البيض (على سبيل المثال ، CD45) الكيمياء المناعية14 لفحص الكريات البيض. في حين أن هذه الأساليب دقيقة ، إلا أنها مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل التنفيذ السريري على نطاق واسع أمرا صعبا ، خاصة في البلدان النامية.

يتم توزيع البيروكسيديز على نطاق واسع في أنواع مختلفة من الخلايا ويلعب دورا حاسما في مقاومة تلف الإجهاد التأكسدي. الميلوبيروكسيديز (MPO) هو عضو في فصيلة البيروكسيديز التي يتم التعبير عنها بشكل عام في الخلايا المناعية. يتم التعبير عنه بشكل كبير في حبيبات العدلاتالمحبة للعدلات 15,16 ويتم التعبير عنه أيضا في الخلايا الليمفاوية17,18 ، وحيدات ، والبلاعم19. يمكن الحصول على تركيز الكريات البيض ، وخاصة العدلات ، في السائل المنوي عن طريق فحص الخلايا المستديرة الإيجابية للبيروكسيديز7،20. لجعل عملية فحص الكريات البيض في السائل المنوي اقتصادية ومريحة وفعالة ، قمنا بإعادة هندسة طريقة الفحص. بمساعدة نظام تحليل السائل المنوي بمساعدة الكمبيوتر (CASA) ، يمكن الحصول على تركيز الكريات البيض في غضون 60 دقيقة. تقلل هذه الطريقة الجديدة من تكاليف فحص المرضى ووقت الانتظار للحصول على النتائج ، وتخفف من عبء العمل على فنيي المختبرات ، وتقصر فترة انتظار تشخيص الطبيب وعلاجه.

Protocol

تمت مراجعة هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية التابعة للمستشفى الثالث التابع لجامعة صن يات صن. 1. إعداد حل العمل اجمع الكواشف التالية الضرورية لإعداد محلول العمل – محلول ركيزة أورثو تولويدين ، محلول كلوريد الأمونيوم المشبع (NH4Cl) ، ?…

Representative Results

عند تنفيذ الإجراء المذكور أعلاه ، يظهر المتفاعل في أنبوب الطرد المركزي في كثير من الأحيان مظهرا شبه شفاف وبراق (الشكل 1). الكشف عن اللون البني الواضح يكشف عن احتمال تحلل كريات الدم البيضاء ، مما قد يؤدي إلى تلطيخ السائل. وبالتالي ، يمكن أن تفشل عملية التلوين ، مما يجعل من الض?…

Discussion

أورثو تولويدين وبيروكسيد الهيدروجين لهما خصائص حساسة للضوء ويمكن أن تتحلل عند تعرضها للضوء. لضمان فعالية كواشف الاختبار ، يوصى بتخزين سائل العمل المحضر في مكان مظلم.

تظهر عينات السائل المنوي بشكل طبيعي خصائص غير متجانسة. في عملية تحضير عينات السائل المنوي ، يعد الحكم بشكل …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفون ممتنون لمختبر أمراض الذكورة التابع لمركز الطب التناسلي ، المستشفى الثالث التابع لجامعة صن يات صن ، لتوفير التسهيلات لهذه الدراسة. لم يشارك أي تمويل في إعداد هذه المقالة.

Materials

148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD 20230301 Agentia B
6% (v/v) hydrogen peroxide solution ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD 20230301 Agentia D
Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE  Microptic S.L. 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment
Disposable centrifugal tube (1.5 mL) Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD 2210009 Centrifugal tube for Staining process
Disposable transfer pipette (3 mL) Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD 20221101 Polymer-based pipette
Electronic counter None None A multichannel counter
Electronic scales Shanghai Liangping Instrument Co., LTD D9008084 MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g
Makler counting chamber Makler MQ30004 0.01 sq.mm, 10 μm deep
Optical microscope Olympus 3G41067201307 CX31, 10×40
Ortho-toluidine substrate solution ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD 20230301 Agentia C
Pipet tips(1 mL) Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd 02923205 1000 tips/unit, 5 units/case
Pipet tips(10 µL) Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd 00323961 1000 tips/unit, 20 units/case
Pipet tips(200 µL) Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd 32822810 1000 tips/unit, 20 units/case
Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD 20230301 Agentia A
SCA counting chamber Microptic S.L. 102230608 10 µm, 2 Chambers
The container for semen sample Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD 20230701 Polymer-based receptacle for semen sample
Thermostatic table Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD MQ30004 MQ-300
Transfer pipette (10 µL) Eppendoff 3121000.015
Transfer pipette (1000 µL) Eppendoff 3121000.12
Transfer pipette (200 µL) Eppendoff 3121000.082
Two-dimensional shaker DragonLab 822000010000 VC5A002205

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
  2. Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
  3. Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
  4. Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
  5. Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
  6. Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
  7. Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
  8. World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
  9. Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
  10. Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
  11. Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
  12. Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
  13. Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
  14. Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
  15. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
  16. Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
  17. Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
  18. Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
  19. Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
  20. Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
  21. Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
  22. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).

Play Video

Cite This Article
Li, X., Cai, X., Cai, L., Ou, J. The Examination of Peroxidase-Positive Leukocytes in Semen. J. Vis. Exp. (203), e66211, doi:10.3791/66211 (2024).

View Video