בדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני ויעיל לבדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים החיוביים לפרוקסידז בזרע תוך 60 דקות בסך הכל, ובכך לשפר ביעילות את היעילות של מעבדה אנדרולוגית ואנדרולוגים.
Abstract
לוקוציטוספרמיה יכולה להוביל לירידה בתנועתיות הזרעונים, הפרעות מורפולוגיות מוגברות בזרעונים, עלייה במדד פיצול ה- DNA של הזרעונים, פגיעה בתפקוד אקרוזום הזרעונים, ואפילו התפתחות עוברית מושפעת. זוהי מחלה אנדרולוגית נפוצה בפרקטיקה הקלינית ואחד הגורמים החשובים לאי פוריות הגבר. כאשר קובעים אם קיימת דלקת בדרכי הרבייה הגברית, אנדרולוגים בוחרים לעתים קרובות לבחון תאים עגולים או אלסטאז פלזמה זרע בזרע כבסיס אבחוני קליני. עם זאת, בדיקת תאים עגולים מושפעת בקלות מתאי זרע מושחתים ותאי אפיתל בדרכי הרבייה, שאינם תורמים להפחתת השימוש חסר ההבחנה והמיותר באנטיביוטיקה. יחד עם זאת, תהליך הגילוי של אלסטאז הוא מסובך יחסית, גוזל זמן ואיטי בדיווח על תוצאות, מה שאינו מועיל לאבחון מוקדם וטיפול במחלות כגון דלקות בדרכי המין הגבריות (MGTI). יישמנו באופן חדשני את הבדיקה של לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע בסיוע מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA) כקריטריון אבחון עבור לויקוציטוספרמיה, ופתרנו בהצלחה בעיות אלה. בדיקה זו דורשת רק תוספת של נוזל הפעולה המורכב מארבעה ריאגנטים לתוך הדגימה, ואת זמן התגובה הכולל בטמפרטורת החדר ניתן לשלוט בתוך 20-30 דקות. עם כתם הבא בדיקה מיקרוסקופית, ריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase בזרע ניתן להשיג בתוך סך של 60 דקות, אשר ניתן להשתמש בו כדי לאבחן אם דלקת של מערכת הרבייה הגברית קיים.
Introduction
אי פוריות התפתחה כבעיה עולמית של בריאות הציבור המשפיעה על כ -15% מהזוגות בגיל הפוריות שלהם. גורמים גבריים נתרמים על ידי כ -50% מכלל מקרי תת-פוריות, וכמעט 20% עד 30% ניתן לייחס אך ורק לגורמים גבריים 1,2,3. זיהומים בדרכי המין הגבריים (MGTIs) מהווים את אחד הגורמים המשמעותיים לאי פוריות הגבר, ומהווים כ -15% מהמקרים 4,5.
לרוב האנשים יש לויקוציטים בזרע שלהם, המהווים 13% מהתאים שאינם זרעונים, כאשר הפרופורציות השונות הן נויטרופילים 12%, מקרופאגים 0.9% ולימפוציטים 0.1%6,7. על פי מדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לבדיקה ועיבוד של זרע אנושי (מהדורה 5), לויקוציטוספרמיה מוגדרת בדרך כלל כנוכחות של >1 × 106 תאים / מ”ל לויקוציטים בזרע8. מצב זה יכול להיגרם על ידי גורמים רבים כגון רעלים סביבתיים, שימוש בסמים, וריקוצלות, MGTI וכו ‘, כולם עלולים להוביל לעלייה חריגה בריכוז לויקוציטים בזרע9. לויקוציטים יכולים להעלות את רמות החמצן הריאקטיבי (ROS) בזרע, ולגרום לחמצון שומנים ולנזק חמצוני לחלבון ולדנ”א, מה שגורם לירידה בתנועתיות הזרעונים, לעלייה בהפרעות מורפולוגיות בזרעונים, לעלייה במדד פיצול הדנ”א של הזרעונים, לפגיעה בתפקוד אקרוזום הזרעונים ואפילו להשפעות שליליות על התפתחות העובר10,11.
כיום, אנדרולוגים בדרך כלל בוחרים לבחון תאים עגולים בזרע או אלסטאז בפלסמת הזרע בעת זיהוי דלקת בדרכי המין. עם זאת, לעתים קרובות מאתגר להבחין בין תאי זרע משופשפים לבין תאי אפיתל של דרכי הרבייה, שאינם תורמים להפחתת השימוש חסר ההבחנה והמיותר באנטיביוטיקה6. שיטת הבדיקה האחרונה מסובכת יחסית וגוזלת זמן, עם דיווח תוצאות איטי, שאינו מועיל לאבחון מוקדם וטיפול במחלות כגון MGTIs. האגודה האורולוגית האמריקאית (AUA) מציעה כי יש לבצע התמיינות נוספת בין לויקוציטים לתאים ממערכת איברי המין כאשר ריכוז התאים העגולים בניתוח זרע גדול מ- 1 × 106 תאים / מ”ל12. מעבדות אנדרולוגיה מסוימות משתמשות בציטומטריית זרימה13 או אנטיגן לויקוציטים (למשל, CD45) אימונוציטוכימיה14 כדי לבחון לויקוציטים. בעוד שיטות אלה מדויקות, הן יקרות וגוזלות זמן, מה שמקשה על יישום קליני בקנה מידה גדול, במיוחד במדינות מתפתחות.
פרוקסידז מופץ באופן נרחב בסוגים שונים של תאים וממלא תפקיד מכריע בעמידות לנזקי עקה חמצונית. Myeloperoxidase (MPO) הוא חבר בתת-משפחת הפרוקסידז המתבטא בדרך כלל בתאי מערכת החיסון. הוא מתבטא בצורה הגבוהה ביותר בגרגירים אזורופיליים15,16 של נויטרופילים ומתבטא גם בלימפוציטים17,18, מונוציטים ומקרופאגים19. ריכוז לויקוציטים, במיוחד נויטרופילים, בזרע ניתן להשיג על ידי בחינת תאים עגולים שהם חיוביים peroxidase 7,20. כדי להפוך את תהליך הבדיקה של לויקוציטים בזרע לחסכוני, נוח ויעיל, הנדסנו מחדש את שיטת הבדיקה. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים תוך 60 דקות. שיטה חדשה זו מפחיתה את עלויות הבדיקה של המטופלים ואת זמן ההמתנה לקבלת תוצאות, מקלה על עומס העבודה של טכנאי המעבדה ומקצרת את תקופת ההמתנה לאבחון ולטיפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
אורתו-טולוידין ומי חמצן הם בעלי תכונות רגישות לאור ויכולים להתפרק כאשר הם נחשפים לאור. כדי להבטיח את האפקטיביות של ריאגנטים הבדיקה, מומלץ לאחסן את נוזל העבודה מוכן במקום חשוך.
דגימות זרע מציגות באופן טבעי מאפיינים הטרוגניים. בתהליך ההכנה של דגימות זרע, שיפוט נכון של מצב ההנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה למעבדה האנדרולוגית של המרכז לרפואת רבייה, בית החולים המסונף השלישי של אוניברסיטת סון יאט-סן, על אספקת המתקנים למחקר זה. לא היה מעורב מימון בהכנת מאמר זה.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
