Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני ויעיל לבדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים החיוביים לפרוקסידז בזרע תוך 60 דקות בסך הכל, ובכך לשפר ביעילות את היעילות של מעבדה אנדרולוגית ואנדרולוגים.
Abstract
לוקוציטוספרמיה יכולה להוביל לירידה בתנועתיות הזרעונים, הפרעות מורפולוגיות מוגברות בזרעונים, עלייה במדד פיצול ה- DNA של הזרעונים, פגיעה בתפקוד אקרוזום הזרעונים, ואפילו התפתחות עוברית מושפעת. זוהי מחלה אנדרולוגית נפוצה בפרקטיקה הקלינית ואחד הגורמים החשובים לאי פוריות הגבר. כאשר קובעים אם קיימת דלקת בדרכי הרבייה הגברית, אנדרולוגים בוחרים לעתים קרובות לבחון תאים עגולים או אלסטאז פלזמה זרע בזרע כבסיס אבחוני קליני. עם זאת, בדיקת תאים עגולים מושפעת בקלות מתאי זרע מושחתים ותאי אפיתל בדרכי הרבייה, שאינם תורמים להפחתת השימוש חסר ההבחנה והמיותר באנטיביוטיקה. יחד עם זאת, תהליך הגילוי של אלסטאז הוא מסובך יחסית, גוזל זמן ואיטי בדיווח על תוצאות, מה שאינו מועיל לאבחון מוקדם וטיפול במחלות כגון דלקות בדרכי המין הגבריות (MGTI). יישמנו באופן חדשני את הבדיקה של לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע בסיוע מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA) כקריטריון אבחון עבור לויקוציטוספרמיה, ופתרנו בהצלחה בעיות אלה. בדיקה זו דורשת רק תוספת של נוזל הפעולה המורכב מארבעה ריאגנטים לתוך הדגימה, ואת זמן התגובה הכולל בטמפרטורת החדר ניתן לשלוט בתוך 20-30 דקות. עם כתם הבא בדיקה מיקרוסקופית, ריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase בזרע ניתן להשיג בתוך סך של 60 דקות, אשר ניתן להשתמש בו כדי לאבחן אם דלקת של מערכת הרבייה הגברית קיים.
Introduction
אי פוריות התפתחה כבעיה עולמית של בריאות הציבור המשפיעה על כ -15% מהזוגות בגיל הפוריות שלהם. גורמים גבריים נתרמים על ידי כ -50% מכלל מקרי תת-פוריות, וכמעט 20% עד 30% ניתן לייחס אך ורק לגורמים גבריים 1,2,3. זיהומים בדרכי המין הגבריים (MGTIs) מהווים את אחד הגורמים המשמעותיים לאי פוריות הגבר, ומהווים כ -15% מהמקרים 4,5.
לרוב האנשים יש לויקוציטים בזרע שלהם, המהווים 13% מהתאים שאינם זרעונים, כאשר הפרופורציות השונות הן נויטרופילים 12%, מקרופאגים 0.9% ולימפוציטים 0.1%6,7. על פי מדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לבדיקה ועיבוד של זרע אנושי (מהדורה 5), לויקוציטוספרמיה מוגדרת בדרך כלל כנוכחות של >1 × 106 תאים / מ"ל לויקוציטים בזרע8. מצב זה יכול להיגרם על ידי גורמים רבים כגון רעלים סביבתיים, שימוש בסמים, וריקוצלות, MGTI וכו ', כולם עלולים להוביל לעלייה חריגה בריכוז לויקוציטים בזרע9. לויקוציטים יכולים להעלות את רמות החמצן הריאקטיבי (ROS) בזרע, ולגרום לחמצון שומנים ולנזק חמצוני לחלבון ולדנ"א, מה שגורם לירידה בתנועתיות הזרעונים, לעלייה בהפרעות מורפולוגיות בזרעונים, לעלייה במדד פיצול הדנ"א של הזרעונים, לפגיעה בתפקוד אקרוזום הזרעונים ואפילו להשפעות שליליות על התפתחות העובר10,11.
כיום, אנדרולוגים בדרך כלל בוחרים לבחון תאים עגולים בזרע או אלסטאז בפלסמת הזרע בעת זיהוי דלקת בדרכי המין. עם זאת, לעתים קרובות מאתגר להבחין בין תאי זרע משופשפים לבין תאי אפיתל של דרכי הרבייה, שאינם תורמים להפחתת השימוש חסר ההבחנה והמיותר באנטיביוטיקה6. שיטת הבדיקה האחרונה מסובכת יחסית וגוזלת זמן, עם דיווח תוצאות איטי, שאינו מועיל לאבחון מוקדם וטיפול במחלות כגון MGTIs. האגודה האורולוגית האמריקאית (AUA) מציעה כי יש לבצע התמיינות נוספת בין לויקוציטים לתאים ממערכת איברי המין כאשר ריכוז התאים העגולים בניתוח זרע גדול מ- 1 × 106 תאים / מ"ל12. מעבדות אנדרולוגיה מסוימות משתמשות בציטומטריית זרימה13 או אנטיגן לויקוציטים (למשל, CD45) אימונוציטוכימיה14 כדי לבחון לויקוציטים. בעוד שיטות אלה מדויקות, הן יקרות וגוזלות זמן, מה שמקשה על יישום קליני בקנה מידה גדול, במיוחד במדינות מתפתחות.
פרוקסידז מופץ באופן נרחב בסוגים שונים של תאים וממלא תפקיד מכריע בעמידות לנזקי עקה חמצונית. Myeloperoxidase (MPO) הוא חבר בתת-משפחת הפרוקסידז המתבטא בדרך כלל בתאי מערכת החיסון. הוא מתבטא בצורה הגבוהה ביותר בגרגירים אזורופיליים15,16 של נויטרופילים ומתבטא גם בלימפוציטים17,18, מונוציטים ומקרופאגים19. ריכוז לויקוציטים, במיוחד נויטרופילים, בזרע ניתן להשיג על ידי בחינת תאים עגולים שהם חיוביים peroxidase 7,20. כדי להפוך את תהליך הבדיקה של לויקוציטים בזרע לחסכוני, נוח ויעיל, הנדסנו מחדש את שיטת הבדיקה. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים תוך 60 דקות. שיטה חדשה זו מפחיתה את עלויות הבדיקה של המטופלים ואת זמן ההמתנה לקבלת תוצאות, מקלה על עומס העבודה של טכנאי המעבדה ומקצרת את תקופת ההמתנה לאבחון ולטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המסונף השלישי של אוניברסיטת סון יאט-סן.
1. הכנת פתרון העבודה
- אסוף את הריאגנטים הבאים החיוניים להכנת תמיסת העבודה - תמיסת מצע אורתו-טולוידין, תמיסת אמוניום כלורי רווי (NH4Cl), תמיסת מלח דיסודיום 148 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid (Na2EDTA) ותמיסת מי חמצן 6% (v/v). הניחו אותם על ספסל מעבדה בטמפרטורת החדר (RT) יחד עם הכלים הדרושים, כגון פיפטות העברה (1000 μL, 200 μL, 10 μL) ומדפי מבחנה.
התראה: קרא את גיליון נתוני הבטיחות (SDS) לפני הטיפול בריאגנטים שהוזכרו לעיל. - הכינו בקבוק מגיב חום אטום לאחסון והגנה על פתרון העבודה המוכן מפני חשיפה לאור.
- העבירו את הריאגנטים לבקבוק מגיב חום אטום בהתאם לפרופורציות המפורטות להלן:
- נצלו את פיפטת ההעברה של 200 μL וכווננו את קנה המידה ל-100 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, העבירו 100 μL של תמיסת NH4Cl לבקבוק מגיב חום אטום.
- החלף את קצה פיפטה והעבר 100 μL של תמיסת 148 mmol / L Na2EDTA לבקבוק מגיב חום אטום באמצעות פיפטת העברה 200 μL שהוזכרה לעיל. לאחר מכן, לנשוף בעדינות על ידי pipetting ו homogenize ביסודיות את הפתרון.
- נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-900 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, להעביר 900 μL של תמיסת המצע ortho-toluidine לתוך בקבוק מגיב חום אטום, לנשוף בעדינות על ידי pipetting, והומוגני ביסודיות את התמיסה.
- נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-5 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, העבירו 5 μL של תמיסת מי חמצן 6% (v/v) לבקבוק מגיב חום אטום.
- נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-1000 μL על ידי סיבוב הידית. מחליפים את קצה הפיפטה, נושפים בעדינות על ידי פיפטינג, ומהומוגניים היטב את התמיסה בבקבוק מגיב חום אטום.
- אחסן את פתרון העבודה המוכן לשימוש בבקבוק מגיב חום אטום ב- RT, הרחק מאור. פתרון העבודה הוא תגובתי במשך 24 שעות.
- כל דגימת זרע דורשת 900 μL של פתרון העבודה. יש לוודא כי כמות פתרון העבודה המוכן בכל יום תואמת את מספר הדגימות הנבדקות מדי יום.
2. הכנת דגימת זרע
- לפני איסוף דגימת הזרע, ודא שהמטופל נמנע משפיכה במשך 2 עד 7 ימים כנדרש במדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לבדיקה ועיבוד זרע אנושי (מהדורה 5). 8. אוננות היא השיטה המועדפת לקבלת דגימות זרע. כדי לשפר את דיוק הבדיקה, להנחות את המטופל לאסוף את כל הזרע שנפלט.
- הפעל את עמדת הטמפרטורה הקבועה וחמם עד 37 מעלות צלזיוס מראש, כך שהנזלה הבאה של דגימת הזרע תוכל להמשיך בצורה חלקה.
- עם קבלת דגימת הזרע של המטופל, יש לתעד בקפדנות מידע מפורט, כולל קוד זיהוי, זמן איסוף, משך התנזרות ומידע רלוונטי אחר, על הקיר החיצוני של כלי הקיבול מבוסס הפולימר.
- הניחו את כלי הקיבול על בסיס פולימר המאכלס את דגימת הזרע על מעמד הטמפרטורה הקבוע שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס, מה שמועיל להנזלת הזרע.
- ציירו את דגימת הזרע לתוך פיפטה על בסיס פולימר והתבוננו במצב ההנזלה כל 5 דקות עד שדגימת הזרע נוזלית במלואה.
- אם דגימת הזרע לא נוזלה במלואה תוך 30 דקות, אל תבצע את הבדיקה עדיין; המשיכו להמתין עוד 30 דקות. אם הזרע עדיין לא נוזלי במלואו לאחר 60 דקות, הוסף נפח שווה של תמיסת חיץ פוספט לדילול 1:1 והתסיס בעדינות כדי לקדם הנזלה.
- לאחר תסיסה יסודית והומוגניזציה עקבית, שמור על דגימת הזרע הנוזלית במלואה להליכי הבדיקה הבאים.
3. צביעה של לויקוציטים חיוביים peroxidase וניתוח מדגם הזרע המקורי
- לפני הדגימה, יש להשתמש בפיפט על בסיס פולימר כדי לנשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג ולבצע הומוגניות יסודית בדגימת הזרע הנבדקת.
- נצלו את פיפטת ההעברה של 200 μL וכווננו את קנה המידה ל-100 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה פיפטה, ולאחר מכן להעביר 100 μL של דגימת הזרע לתוך צינור צנטריפוגה.
- נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-900 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה פיפטה, ולאחר מכן להעביר 900 μL של פתרון העבודה הנ"ל לתוך צינור הצנטריפוגה.
- מכה חוזרת ונשנית על ידי pipetting הומוגניזציה ביסודיות את המגיב, אשר מורכב מדגם זרע פתרון עבודה, באמצעות פיפטה העברה 1000 μL.
- מקם את צינור הצנטריפוגה במתלה מבחנה על שייקר דו-ממדי והפעל תסיסה רציפה ב-200 סל"ד למשך 30 דקות ב-RT.
- בזמן ההמתנה לתגובת הצביעה, נתח את דגימת הזרע באמצעות מערכת CASA כדי לקבוע את ריכוז הזרעונים בדגימת הזרע המקורית בכלי הקיבול מבוסס הפולימר.
- הפעל את מתג ההפעלה של מערכת CASA ולחץ פעמיים על סמל SCA SCOPE כדי לפתוח את תוכנת היישום.
- לפני הדגימה, יש לנשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג ולבצע הומוגניות יסודית של דגימת הזרע המקורית שוב עם פיפטה על בסיס פולימר.
- נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-10 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה הפיפטה, פיפטה עד 10 μL של דגימת הזרע המקורית, והכנס אותו לתא ספירת SCA. המתן 60 שניות עד שדגימת הזרע תפסיק להיסחף.
- מקם את תא ספירת ה- SCA על מחזיק הדגימה של מערכת CASA והגדר את פרטי המטופל בתיבת הדו-שיח של תוכנת היישום כדי להתכונן לבדיקה הרשמית.
- בדוק את דגימת הזרע המקורית בתא ספירת SCA עם מערכת CASA על ידי לחיצה על לחצן התחל ורשום את הנתונים הדרושים, כגון ריכוז הזרעונים.
4. תצפית על לויקוציטים חיוביים peroxidase ו spermatozoa
- נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-1000 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה הפיפטה, ואז נשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג והומוגניזציה יסודית של המגיב, המורכב מדגימת זרע ותמיסת עבודה בצינור הצנטריפוגה שוב בסוף תהליך התגובה של 30 דקות.
- נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-10 μL על ידי סיבוב הידית. החליפו את קצה הפיפטה, פיפטה במעלה 10 מיקרוליטר של המגיב שהוזכר לעיל, והכניסו אותה לתא ספירת הזרע. לבסוף, כסו את תא ספירת הזרע בכיסוי זכוכית ייעודי.
- הניחו את תא ספירת הזרע על השלב המיקרוסקופי והפעילו את מתג ההפעלה של המיקרוסקופ האופטי באמצעות שתי עיניות 10x. לאחר מכן, המתן 60 שניות עד שהדגימה המגיבה תפסיק להיסחף.
- העבר את הממיר המיקרוסקופי לעדשת האובייקט 10x במהלך זמן ההמתנה. לאחר מכן כוונן את ידית הכוונון הגסה ואת ידית הכוונון העדינה ברצף. לבסוף, התבוננו בזרעונים ובתאים עגולים תחת הגדלה של 10×10.
- החלף את הממיר המיקרוסקופי לעדשה האובייקטיבית 40x לאחר קביעת שדה הראייה שיש לנתח, והתבונן בזרעונים ובלויקוציטים חיוביים לפרוקסידז חום תחת הגדלה של 10 × 40.
- השתמש במערכת המונה האלקטרוני כדי לספור לפחות 200 זרעונים ואת מספר לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז חום בתוך השדות המתאימים.
5. חישוב הריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase
- חישוב הריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase באמצעות הנוסחה הבאה:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעת יישום ההליך שהוזכר לעיל, המגיב בצינור הצנטריפוגה מפגין לעתים קרובות מראה תת-שקוף ואטום, (איור 1). זיהוי צבע חום ברור חושף degranulation פוטנציאלי של לויקוציטים, אשר עלול לגרום כתמים נוזליים. כתוצאה מכך, תהליך הצביעה עלול להיכשל, ולכן יש צורך להכתים מחדש או לאסוף דגימת זרע חדשה לבדיקה חוזרת21.
לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז הציגו גוון חום, בניגוד לתאים עגולים רגילים לא מוכתמים (איור 2, שקופית רגילה). לאחר מכן, כל זרעונים ולויקוציטים חומים תחת שדה המיקרוסקופ הנוכחי נספרו לפני המעבר לשדה חדש לחלוטין לתצפית ומדידה רציפה. כדי להבטיח דיוק אופטימלי, יש צורך לספור מינימום של 200 זרעונים ואת leukocytes נוכח בשדה הראייה המתאים.
איור 1: תמיסת מגיבים. המגיב המשלים את תהליך התגובה הוא נוזל אטום תת-שקוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תצפית במיקרוסקופ אופטי (שקופית רגילה). (A) לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז ו-(B) תא עגול רגיל שנצפה במיקרוסקופ אופטי בהגדלה של 10 x 40. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אורתו-טולוידין ומי חמצן הם בעלי תכונות רגישות לאור ויכולים להתפרק כאשר הם נחשפים לאור. כדי להבטיח את האפקטיביות של ריאגנטים הבדיקה, מומלץ לאחסן את נוזל העבודה מוכן במקום חשוך.
דגימות זרע מציגות באופן טבעי מאפיינים הטרוגניים. בתהליך ההכנה של דגימות זרע, שיפוט נכון של מצב ההנזלה של הזרע והומוגניות יסודית של דגימות הזרע לפני כל דגימה הם קריטיים לשיפור אמינות תוצאות הבדיקה. דגימות זרע נוזליות לחלוטין תוך 15 דקות. הומוגניזציה מכנית או עיכול אנזימטי צריך להיחשב אם הם לא נוזלי לחלוטין לאחר 60 דקות. ניתן להשיג דגימות זרע הומוגניות יותר על ידי ניעור עדין של מיכל הדגימה ברציפות במהלך תהליך ההנזלה באמצעות שייקר דו מימדי8.
שיטת הבדיקה המוצגת במאמר זה טומנת בחובה יתרונות של פשטות, מהירות ועלות-תועלת. עם זאת, זה לא יכול להיות יתרון בנסיבות מסוימות: peroxidase מאוחסן גרגירים azurophilic כי יופרשו לתוך החלל הבין-תאי באמצעות degranulation או cytopempsis עם ההפעלה21,22. כתוצאה מכך, נויטרופילים עלולים להיכשל ולהכתים ולא ניתן לזהותם. במקרים כאלה, יש צורך לחזור על תהליך הצביעה או אפילו לדרוש מהמטופל לספק דגימת זרע חדשה לבדיקה חוזרת. כדי למזער מצב זה, מומלץ להשתמש בדגימות זרע טריות במידת האפשר עם זמן מיקום מינימלי ותהליך הומוגני עדין. שיטה זו יכולה לזהות רק מחלות פעילות או זיהומים ואינה יכולה לזהות מחלות בשלבים מאוחרים יותר, כגון זיהומים כרוניים16. בנוסף, סוגים אחרים של לויקוציטים עם תוכן peroxidase נמוך יותר, כגון לימפוציטים, מקרופאגים, מונוציטים, מהווים קשיים צביעה באמצעות שיטה זו; לפיכך, השגת תוצאות אמינות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש אנטיגן לויקוציטים (למשל, CD45) צביעה immunohistochemical.
כנדרש על ידי המהדורה החמישית של מדריך ארגון הבריאות העולמי, צביעת myeloperoxidase חיובית מסורתית (בדיקת Endtz) דורשת ספירה מיקרוסקופית של לפחות 200 לויקוציטים חיוביים peroxidase בצלחת ספירת תאי דם כדי לחשב את ריכוזם8. בהשוואה לבדיקת Endtz הידנית המסורתית, פרוטוקול זה מציג את נתוני ריכוז הזרעונים המתקבלים על ידי זיהוי CASA, תוך שילוב שיטות ידניות ואוטומטיות. כדי לחשב את הריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase, לפחות 200 זרעונים ו leukocytes בשדה הראייה המתאים נספרו תחת מיקרוסקופ. מכיוון שריכוז הזרעונים בזרע גדול בהרבה מזה של לויקוציטים, נדרש פחות זמן כדי לספור 200 זרעונים בהשוואה לספירת 200 לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז.
חולים עם אוליגוספרמיה חמורה, cryptozoospermia, ו azoospermia לעתים קרובות להתמודד עם אתגרים בספירת מספר מספיק של זרעונים. במקרים כאלה, ניתן לחשב ישירות את ריכוז הלויקוציטים החיוביים לפרוקסידז באמצעות צלחת ספירת תאי דם כמתואר במדריך לצלחת. בנוסף, עבור חולים שאינם זקוקים ל- CASA או למעבדות ללא ציוד CASA, ניתן להשתמש בצלחת ספירת תאי דם גם כדי לקבוע את הריכוז של לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה למעבדה האנדרולוגית של המרכז לרפואת רבייה, בית החולים המסונף השלישי של אוניברסיטת סון יאט-סן, על אספקת המתקנים למחקר זה. לא היה מעורב מימון בהכנת מאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L.
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J.
