Summary
В данной работе представлен экономичный и эффективный протокол исследования пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме. С помощью системы автоматизированного анализа спермы (CASA) можно получить концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме в течение 60 минут, эффективно повышая эффективность работы андрологической лаборатории и андрологов.
Abstract
Лейкоцитоспермия может привести к снижению подвижности сперматозоидов, увеличению морфологических аномалий сперматозоидов, повышению индекса фрагментации ДНК сперматозоидов, нарушению функции акросом сперматозоидов и даже к нарушению эмбрионального развития. Это распространенное андрологическое заболевание в клинической практике и одна из важных причин мужского бесплодия. При определении наличия воспаления мужского репродуктивного тракта андрологи часто выбирают исследование круглых клеток или семенной плазменной эластазы в сперме в качестве клинико-диагностической основы. Однако на исследование круглых клеток легко влияют отшелушивающиеся сперматогенные клетки и эпителиальные клетки репродуктивного тракта, которые не способствуют уменьшению беспорядочного и ненужного применения антибиотиков. В то же время процесс обнаружения эластазы является относительно сложным, трудоемким и медленным в получении результатов, что не способствует ранней диагностике и лечению таких заболеваний, как инфекции мужских половых путей (МГТИ). Мы инновационно применили исследование пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме с помощью системы компьютерного анализа спермы (CASA) в качестве диагностического критерия лейкоцитоспермии, успешно решив эти проблемы. Это исследование требует только добавления рабочей жидкости, состоящей из четырех реагентов, в образец, а общее время реакции при комнатной температуре можно контролировать в течение 20-30 минут. При последующем мазке и микроскопическом исследовании можно получить концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме в общей сложности в течение 60 мин, что может быть использовано для диагностики наличия воспаления мужских половых путей.
Introduction
Бесплодие стало глобальной проблемой общественного здравоохранения, затрагивающей примерно 15% пар в репродуктивном возрасте. Мужские факторы составляют около 50% от общего числа случаев субфертильности, и почти 20-30% могут быть отнесены исключительно к мужским факторам 1,2,3. Инфекции мужских половых путей (МГТИ) являются одной из значимых причин мужского бесплодия, составляя около 15% случаев 4,5.
У большинства людей лейкоциты в сперме составляют 13% несперматозоидных клеток, с дифференциальными пропорциями: нейтрофилы 12%, макрофаги 0,9% и лимфоциты 0,1%6,7. Согласно лабораторному руководству Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по исследованию и обработке спермы человека (5-е изд.), лейкоцитоспермия обычно определяется как наличие >1 × 106 клеток/мл лейкоцитов в сперме8. Это состояние может быть вызвано многочисленными факторами, такими как токсины окружающей среды, злоупотребление психоактивными веществами, варикоцеле, MGTI и т. д., которые потенциально могут привести к аномальному увеличению концентрации лейкоцитов в сперме9. Лейкоциты могут повышать уровень активных форм кислорода (АФК) в сперме, вызывая перекисное окисление липидов и окислительное повреждение белка и ДНК, что приводит к снижению подвижности сперматозоидов, увеличению морфологических аномалий сперматозоидов, повышению индекса фрагментации ДНК сперматозоидов, нарушению функции акросом сперматозоидов и даже негативному влиянию на развитие эмбриона10,11.
В настоящее время андрологи обычно выбирают исследование круглых клеток в сперме или эластазы в семенной плазме при выявлении воспаления половых путей. Тем не менее, часто бывает сложно отличить отшелушивающиеся сперматогенные клетки от эпителиальных клеток репродуктивного тракта, которые не способствуют сокращению беспорядочного и ненужного использования антибиотиков6. Последний метод обследования является относительно сложным и трудоемким, с медленным получением результатов, что не способствует ранней диагностике и лечению таких заболеваний, как MGTI. Американская урологическая ассоциация (AUA) предлагает проводить дальнейшую дифференциацию между лейкоцитами и отшелушенными клетками из половых путей, когда концентрация круглых клеток в спермограмме превышает 1 × 106 клеток/мл12. Некоторые андрологические лаборатории используют проточную цитометрию13 или иммуноцитохимию лейкоцитарного антигена (например, CD45)14 для исследования лейкоцитов. Несмотря на то, что эти методы являются точными, они являются дорогостоящими и трудоемкими, что затрудняет их широкомасштабное клиническое внедрение, особенно в развивающихся странах.
Пероксидаза широко распространена в различных типах клеток и играет решающую роль в устойчивости к окислительному стрессу. Миелопероксидаза (МПО) является членом подсемейства пероксидаза, которое обычно экспрессируется в иммунных клетках. Он наиболее высоко экспрессируется в азурофильных гранулах нейтрофилов15,16, а также в лимфоцитах17,18, моноцитах и макрофагах19. Концентрацию лейкоцитов, особенно нейтрофилов, в сперме можно получить, исследуя круглые клетки, которые являются пероксидазоположительными 7,20. Чтобы сделать процесс исследования лейкоцитов в сперме экономичным, удобным и эффективным, мы модернизировали метод исследования. С помощью системы компьютерного анализа спермы (CASA) концентрация лейкоцитов может быть получена в течение 60 минут. Этот новый метод снижает затраты на обследование пациентов и время ожидания получения результатов, снижает нагрузку на лаборантов, сокращает время ожидания диагноза и лечения у врача.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было рассмотрено и одобрено Комитетом по медицинской этике Третьей филиальной больницы Университета Сунь Ятсена.
1. Приготовление рабочего раствора
- Подготовьте следующие реагенты, необходимые для приготовления рабочего раствора: раствор ортотолуидинового субстрата, раствор насыщенного хлорида аммония (NH4Cl), раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na2ЭДТА) 148 ммоль/л и 6% раствор перекиси водорода. Поместите их на лабораторный стол при комнатной температуре вместе с необходимыми инструментами, такими как пипетки для переноса (1000 мкл, 200 мкл, 10 мкл) и штативы для пробирок.
ВНИМАНИЕ: Прочтите паспорт безопасности (SDS) перед использованием вышеупомянутых реагентов. - Подготовьте непрозрачный флакон с реагентом коричневого цвета для хранения и защиты приготовленного рабочего раствора от воздействия света.
- Переложите реагенты в непрозрачный коричневый флакон с реагентом в соответствии с пропорциями, указанными ниже:
- Используйте пипетку для переноса на 200 мкл и отрегулируйте шкалу до 100 мкл, повернув ручку. Затем перелейте 100 мкл раствора NH4Cl в непрозрачный коричневый флакон с реагентом.
- Замените наконечник пипетки и перелейте 100 мкл раствораNa2ЭДТА 148 ммоль/л в непрозрачный коричневый флакон с реагентом с помощью пипетки для переноса 200 мкл, упомянутой выше. Затем осторожно продуйте пипеткой и тщательно гомогенизируйте раствор.
- Используйте пипетку для переноса на 1000 мкл и отрегулируйте шкалу до 900 мкл, повернув ручку. Затем перелейте 900 мкл раствора ортотолуидинового субстрата в непрозрачный коричневый флакон с реагентом, осторожно продуйте пипеткой и тщательно гомогенизируйте раствор.
- Используйте пипетку для переноса на 10 мкл и отрегулируйте шкалу до 5 мкл, повернув ручку. Затем перелейте 5 мкл 6%-ного (v/v) раствора перекиси водорода в непрозрачный коричневый флакон с реагентом.
- Используйте пипетку для переноса на 1000 мкл и отрегулируйте шкалу на 1000 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, осторожно продуйте пипеткой и тщательно гомогенизируйте раствор в непрозрачном коричневом флаконе с реагентом.
- Храните готовый к использованию рабочий раствор в непрозрачном коричневом флаконе с реагентом в RT, вдали от света. Рабочий раствор реакционноспособен в течение 24 ч.
- На каждый образец спермы требуется 900 мкл рабочего раствора. Следите за тем, чтобы количество рабочего раствора, приготовленного каждый день, соответствовало количеству образцов, исследуемых ежедневно.
2. Подготовка образца спермы
- Перед сбором образца спермы убедитесь, что пациент воздерживался от эякуляции в течение 2-7 дней, как того требует лабораторное руководство Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по исследованию и обработке спермы человека (5-е изд.). 8. Мастурбация является предпочтительным методом получения образцов спермы. Чтобы повысить точность исследования, поручите пациенту собрать всю эякулированную сперму.
- Включите подставку с постоянной температурой и заранее нагрейте до 37 °C, чтобы последующее разжижение образца спермы могло протекать гладко.
- После получения образца спермы пациента тщательно запишите подробную информацию, включая идентификационный код, время сбора, продолжительность воздержания и другую соответствующую информацию, на внешней стенке сосуда на полимерной основе.
- Поместите сосуд на полимерной основе, в котором находится образец спермы, на подставку с постоянной температурой, предварительно нагретую до 37 °C, что благоприятно для разжижения спермы.
- Наберите образец спермы в пипетку на полимерной основе и наблюдайте за состоянием разжижения каждые 5 мин до тех пор, пока образец спермы не станет полностью жидким.
- Если образец спермы не был полностью разжижен в течение 30 минут, исследование пока не проводить; Продолжайте ждать еще 30 мин. Если сперма все еще не полностью разжижена через 60 минут, добавьте равный объем фосфатного буферного раствора для разведения 1:1 и осторожно взболтайте, чтобы способствовать разжижению.
- После тщательного перемешивания и последовательной гомогенизации сохраните полностью разжиженный образец спермы для последующих процедур исследования.
3. Окрашивание пероксидазоположительных лейкоцитов и анализ исходного образца спермы
- Перед отбором проб используйте пипетку на полимерной основе, чтобы многократно продуть пипеткой и тщательно гомогенизировать исследуемый образец спермы.
- Используйте пипетку для переноса на 200 мкл и отрегулируйте шкалу до 100 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, а затем перелейте 100 мкл образца спермы в центрифужную пробирку.
- Используйте пипетку для переноса на 1000 мкл и отрегулируйте шкалу до 900 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, затем перелейте 900 мкл вышеупомянутого рабочего раствора в центрифужную пробирку.
- Многократную продувку пипеткой и тщательную гомогенизацию реагента, состоящего из образца спермы и рабочего раствора, с помощью трансферной пипетки на 1000 мкл.
- Поместите центрифужную пробирку в штатив для пробирок на двухмерный шейкер и подвергните ее непрерывному перемешиванию при 200 об/мин в течение 30 мин при RT.
- В ожидании реакции окрашивания проанализируйте образец спермы с помощью системы CASA для определения концентрации сперматозоидов в исходном образце спермы в сосуде на полимерной основе.
- Включите выключатель питания системы CASA и дважды щелкните значок SCA SCOPE, чтобы открыть прикладное программное обеспечение.
- Перед отбором проб многократно продуйте пипеткой и снова тщательно гомогенизируйте исходный образец спермы с помощью пипетки на полимерной основе.
- Используйте пипетку для переноса на 10 мкл и отрегулируйте шкалу до 10 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, наберите на 10 мкл исходного образца спермы и поместите его в счетную камеру SCA. Подождите 60 секунд, чтобы образец спермы перестал дрейфовать.
- Расположите счетную камеру SCA на держателе образца системы CASA и введите информацию о пациенте в диалоговом окне прикладного программного обеспечения для подготовки к формальному исследованию.
- Исследуйте исходный образец спермы в камере подсчета SCA с помощью системы CASA, нажав кнопку «Пуск », и запишите необходимые данные, такие как концентрация сперматозоидов.
4. Наблюдение за пероксидазоположительными лейкоцитами и сперматозоидами
- Используйте пипетку для переноса на 1000 мкл и отрегулируйте шкалу на 1000 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, затем несколько раз продуйте пипеткой и тщательно гомогенизируйте реагент, который состоит из образца спермы и рабочего раствора в центрифужной пробирке, снова в конце 30-минутного процесса реакции.
- Используйте пипетку для переноса на 10 мкл и отрегулируйте шкалу до 10 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, намочите 10 мкл упомянутого выше реагента и поместите его в камеру для подсчета сперматозоидов. Наконец, накройте камеру для подсчета сперматозоидов специальным стеклянным покровным листом.
- Поместите камеру для подсчета сперматозоидов на микроскопический столик и включите выключатель питания оптического микроскопа с двумя 10-кратными окулярами. Затем подождите 60 с, пока образец реагента не прекратит дрейфовать.
- Переключите микроскопический конвертер на объектив с 10-кратным увеличением во время ожидания. Затем последовательно отрегулируйте ручку грубой регулировки и ручку точной регулировки. Наконец, понаблюдайте за сперматозоидами и круглыми клетками при увеличении 10×10.
- Переключите микроскопический конвертер на линзу объектива 40x после определения поля зрения, подлежащего анализу, и наблюдайте за сперматозоидами и коричневыми пероксидазоположительными лейкоцитами при увеличении 10 × 40.
- Используйте электронную систему счетчика для подсчета не менее 200 сперматозоидов и количества бурых пероксидазоположительных лейкоцитов в соответствующих полях.
5. Расчет концентрации пероксидазоположительных лейкоцитов
- Рассчитайте концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов по следующей формуле:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После выполнения вышеупомянутой процедуры реагент в центрифужной пробирке часто проявляет субпрозрачный опалесцирующий вид (Рисунок 1). Обнаружение явно коричневого цвета свидетельствует о потенциальной дегрануляции лейкоцитов, что может привести к окрашиванию жидкости. Следовательно, процесс окрашивания может привести к сбою, что приведет к необходимости либо повторного окрашивания, либо сбора нового образца спермы для повторного тестирования21.
Пероксидаза-положительные лейкоциты имели коричневый оттенок, контрастирующий с неокрашенными обычными круглыми клетками (рис. 2, обыкновенный слайд). Впоследствии, каждый сперматозоид и коричневый лейкоцит под текущим полем микроскопа были подсчитаны, прежде чем перейти в совершенно новое поле для непрерывного наблюдения и подсчета. Для обеспечения оптимальной точности необходимо подсчитать минимум 200 сперматозоидов и лейкоцитов, присутствующих в соответствующем поле зрения.
Рисунок 1: Раствор реагента. Реагент, завершающий процесс реакции, представляет собой субпрозрачную опалесцирующую жидкость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Наблюдение под оптическим микроскопом (обыкновенным предметным стеклом). (А) пероксидаза-позитивный лейкоцит и (Б) обычная круглая клетка, наблюдаемая в оптическом микроскопе с увеличением 10 х 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Орто-толуидин и перекись водорода обладают светочувствительными свойствами и могут разлагаться под воздействием света. Для обеспечения эффективности испытуемых реагентов приготовленную рабочую жидкость рекомендуется хранить в темном месте.
Образцы спермы, естественно, обладают гетерогенными характеристиками. В процессе подготовки образцов спермы правильная оценка степени разжижения спермы и тщательная гомогенизация образцов спермы перед каждым отбором проб имеют решающее значение для повышения надежности результатов испытаний. Образцы спермы полностью разжижаются в течение 15 минут. Механическую гомогенизацию или ферментативное сбраживание следует рассматривать, если они не полностью разжижаются через 60 мин. Более однородные образцы спермы могут быть получены путем непрерывного осторожного встряхивания контейнера с образцом в процессе сжижения с помощью двумерного шейкера8.
Метод исследования, представленный в данной работе, обладает такими преимуществами, как простота, быстрота и экономичность. Однако при определенных обстоятельствах это может быть невыгодно: пероксидаза хранится в азурофильных гранулах, которые при активации будут секретироваться в межклеточное пространство путем дегрануляции или цитопемпсиса21,22. Следовательно, нейтрофилы могут не окрашиваться и не могут быть идентифицированы. В таких случаях возникает необходимость повторить процесс окрашивания или даже потребовать от пациента предоставить новый образец спермы для повторного исследования. Чтобы свести к минимуму эту ситуацию, рекомендуется по возможности использовать свежие образцы спермы с минимальным временем размещения и щадящим процессом гомогенизации. Этот метод позволяет выявлять только активные заболевания или инфекции и не может выявлять заболевания на более поздних стадиях, такие как хронические инфекции16. Кроме того, другие типы лейкоцитов с более низким содержанием пероксидазы, такие как лимфоциты, макрофаги и моноциты, создают трудности при окрашивании с помощью этого метода; Таким образом, получение достоверных результатов может быть достигнуто с помощью иммуногистохимического окрашивания на лейкоцитарный антиген (например, CD45).
В соответствии с требованиями 5-го издания руководства ВОЗ, традиционное положительное окрашивание миелопероксидазы (тест Эндца) требует микроскопического подсчета не менее 200 пероксидазоположительных лейкоцитов в планшете для подсчета клеток крови для расчета их концентрации8. По сравнению с традиционным ручным тестом Эндца, этот протокол вводит данные о концентрации сперматозоидов, полученные при обнаружении CASA, комбинируя ручные и автоматические методы. Для расчета концентрации пероксидазоположительных лейкоцитов под микроскопом подсчитывали не менее 200 сперматозоидов и лейкоцитов в соответствующем поле зрения. Поскольку концентрация сперматозоидов в сперме намного больше, чем у лейкоцитов, для подсчета 200 сперматозоидов потребовалось меньше времени по сравнению с подсчетом 200 пероксидаз-положительных лейкоцитов.
Пациенты с тяжелой олигоспермией, криптозооспермией и азооспермией часто сталкиваются с трудностями при подсчете достаточного количества сперматозоидов. В таких случаях концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов можно напрямую рассчитать с помощью планшета для подсчета клеток крови, как описано в инструкции к планшету. Кроме того, для пациентов, которым не требуется CASA, или для лабораторий без оборудования CASA, для определения концентрации пероксидазоположительных лейкоцитов также может использоваться планшет для подсчета клеток крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Андрологической лаборатории Центра репродуктивной медицины, Третьей филиальной больницы Университета Сунь Ятсена, за предоставление возможностей для проведения данного исследования. Никакого финансирования на подготовку этой статьи не было.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L.
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J.
