Summary
Denna artikel presenterar ett ekonomiskt och effektivt protokoll för att undersöka peroxidaspositiva leukocyter i sädesvätska. Med hjälp av ett datorstödt spermaanalyssystem (CASA) kan koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter i sperma erhållas inom totalt 60 minuter, vilket effektivt förbättrar effektiviteten hos andrologilaboratorier och androloger.
Abstract
Leukocytospermi kan leda till minskad spermierörlighet, ökad spermatozomorfologiska avvikelser, förhöjt DNA-fragmenteringsindex för spermier, försämring av spermiernas akrosomfunktion och till och med påverkad embryonal utveckling. Det är en vanlig andrologisk sjukdom i klinisk praxis och en av de viktigaste orsakerna till manlig infertilitet. När man avgör om det finns inflammation i de manliga könsorganen väljer androloger ofta att undersöka runda celler eller sädesplasmaelastas i sädesvätskan som en klinisk diagnostisk grund. Undersökningen av rundceller påverkas dock lätt av borttappade spermatogena celler och epitelceller från reproduktionsorganen, som inte bidrar till att minska den urskillningslösa och onödiga användningen av antibiotika. Samtidigt är detektionsprocessen av elastas relativt komplicerad, tidskrävande och långsam när det gäller att rapportera resultat, vilket inte är fördelaktigt för tidig diagnos och behandling av sjukdomar som manliga genitala infektioner (MGTI). Vi har på ett innovativt sätt tillämpat undersökning av peroxidaspositiva leukocyter i sädesvätska med hjälp av ett datorstödt spermaanalyssystem (CASA) som ett diagnostiskt kriterium för leukocytospermi, och framgångsrikt löst dessa problem. Denna undersökning kräver endast tillsats av driftsvätskan bestående av fyra reagenser i provet, och den totala reaktionstiden vid rumstemperatur kan kontrolleras inom 20-30 minuter. Med efterföljande utstryk och mikroskopisk undersökning kan koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter i sädesvätskan erhållas inom totalt 60 minuter, vilket kan användas för att diagnostisera om inflammation i det manliga könsorganet existerade.
Introduction
Infertilitet har blivit ett globalt folkhälsoproblem som drabbar cirka 15 % av alla par i fertil ålder. Manliga faktorer bidrar med cirka 50 % av de totala subfertilitetsfallen, och nästan 20 % till 30 % kan enbart hänföras till manliga faktorer 1,2,3. Manliga genitala infektioner (MGTI) utgör en av de viktigaste orsakerna till manlig infertilitet och står för cirka 15 % av fallen 4,5.
De flesta individer har leukocyter i sädesvätskan, som utgör 13 % av icke-spermieceller, med differentiella andelar som neutrofiler 12 %, makrofager 0,9 % och lymfocyter 0,1 %6,7. Enligt Världshälsoorganisationens (WHO) laboratoriemanual för undersökning och bearbetning av mänsklig sperma (5:e upplagan) definieras leukocytospermi vanligtvis som närvaron av >1 × 106 celler/ml leukocyter i sperma8. Detta tillstånd kan orsakas av många faktorer som miljögifter, missbruk, varicoceles, MGTI, etc., som alla kan leda till en onormal ökning av leukocytkoncentrationen i sperma9. Leukocyter kan höja nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) i sädesvätskan, vilket orsakar lipidperoxidation och oxidativ skada på protein och DNA, vilket resulterar i minskad spermiemotilitet, ökade morfologiska avvikelser hos spermier, förhöjt DNA-fragmenteringsindex för spermier, försämring av spermiernas akrosomfunktion och till och med negativa effekter på embryoutvecklingen10,11.
För närvarande väljer androloger ofta att undersöka runda celler i sperma eller elastas i sädesplasma när de identifierar inflammation i könsorganen. Det är dock ofta svårt att skilja på borttappade spermatogena celler och epitelceller från reproduktionsorganen, som inte bidrar till att minska den urskillningslösa och onödiga användningen av antibiotika6. Den senare undersökningsmetoden är relativt komplicerad och tidskrävande, med långsam resultatrapportering, vilket inte är gynnsamt för tidig diagnos och behandling av sjukdomar som MGTI. American Urological Association (AUA) föreslår att ytterligare differentiering mellan leukocyter och avvisade celler från könsorganen bör göras när den runda cellkoncentrationen i spermaanalys är större än 1 × 106 celler/ml12. Vissa andrologilaboratorier använder flödescytometri13 eller leukocytantigen (t.ex. CD45) immunocytokemi14 för att undersöka leukocyter. Även om dessa metoder är exakta, är de dyra och tidskrävande, vilket gör storskalig klinisk implementering svår, särskilt i utvecklingsländer.
Peroxidas distribueras i stor utsträckning i olika typer av celler och spelar en avgörande roll för motståndskraften mot oxidativ stressskada. Myeloperoxidas (MPO) är en medlem av underfamiljen peroxidas som vanligtvis uttrycks i immunceller. Det uttrycks starkast i neutrofila azurofila granuler15,16 och uttrycks också i lymfocyter17,18, monocyter och makrofager19. Koncentrationen av leukocyter, särskilt neutrofiler, i sädesvätskan kan erhållas genom att undersöka runda celler som är peroxidaspositiva 7,20. För att göra undersökningsprocessen av leukocyter i sperma ekonomisk, bekväm och effektiv omarbetade vi undersökningsmetoden. Med hjälp av CASA-systemet (datorstödd spermaanalys) kan koncentrationen av leukocyter erhållas inom 60 minuter. Den nya metoden minskar patienternas undersökningskostnader och väntetid för att få resultat, avlastar laboratorieteknikerna och förkortar läkarens diagnos och väntetid för behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie har granskats och godkänts av den medicinska etikkommittén vid The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University.
1. Beredning av arbetslösningen
- Samla upp följande reagenser som är nödvändiga för att bereda arbetslösningen: orto-toluidinsubstratlösning, mättad ammoniumkloridlösning (NH4Cl), 148 mmol/L etylendiamintetraättiksyradinatriumsalt (Na2EDTA) och 6 % (volymprocent) väteperoxidlösning. Placera dem på en laboratoriebänk i rumstemperatur tillsammans med nödvändiga verktyg, såsom överföringspipetter (1000 μL, 200 μL, 10 μL) och provrörsställ.
VARNING: Läs säkerhetsdatabladet (SDS) innan du hanterar ovan nämnda reagens. - Förbered en ogenomskinlig brun reagensflaska för att förvara och skydda den beredda arbetslösningen från exponering för ljus.
- Överför reagenserna till den ogenomskinliga bruna reagensflaskan enligt de proportioner som anges nedan:
- Använd 200 μL överföringspipett och justera skalan till 100 μL genom att vrida på ratten. Överför sedan 100 μl NH4Cl-lösningen till den ogenomskinliga bruna reagensflaskan.
- Sätt tillbaka pipettspetsen och överför 100 μl av 148 mmol/L Na2EDTA-lösningen till den ogenomskinliga bruna reagensflaskan med hjälp av den 200 μL överföringspipett som nämns ovan. Blås sedan försiktigt genom pipettering och homogenisera lösningen noggrant.
- Använd 1000 μL överföringspipett och justera skalan till 900 μL genom att vrida på ratten. Överför sedan 900 μl av den orto-toluidinbaserade substratlösningen till den ogenomskinliga bruna reagensflaskan, blås försiktigt med pipettering och homogenisera lösningen noggrant.
- Använd 10 μL överföringspipett och justera skalan till 5 μL genom att vrida på ratten. Överför sedan 5 μl av väteperoxidlösningen på 6 % (volym/volym) till den ogenomskinliga bruna reagensflaskan.
- Använd 1000 μL överföringspipett och justera skalan till 1000 μL genom att vrida på ratten. Sätt tillbaka pipettspetsen, blås försiktigt genom pipettering och homogenisera lösningen noggrant i den ogenomskinliga bruna reagensflaskan.
- Förvara den färdiga arbetslösningen i den ogenomskinliga bruna reagensflaskan vid RT, borta från ljus. Arbetslösningen är reaktiv i 24 timmar.
- Varje spermaprov kräver 900 μL av arbetslösningen. Se till att den mängd arbetslösning som bereds varje dag motsvarar det antal prover som undersöks dagligen.
2. Beredning av spermaprov
- Innan du samlar in spermaprovet, se till att patienten har avstått från utlösning i 2 till 7 dagar enligt Världshälsoorganisationens (WHO) laboratoriemanual för undersökning och bearbetning av mänsklig sperma (5:e upplagan) 8. Onani är den föredragna metoden för att ta spermaprover. För att förbättra noggrannheten i undersökningen, instruera patienten att samla upp all ejakulerad sperma.
- Slå på konstanttemperaturstativet och värm upp till 37 °C i förväg så att den efterföljande kondenseringen av spermaprovet kan gå smidigt.
- Vid mottagandet av patientens spermaample, registrera noggrant detaljerad information, inklusive identifieringskod, insamlingstid, avhållsamhetstid och annan relevant information, på ytterväggen av den polymerbaserade behållaren.
- Placera det polymerbaserade kärlet med spermaprovet på ett stativ med konstant temperatur som är förvärmt till 37 °C, vilket är fördelaktigt för spermaförvätskningen.
- Dra upp spermaprovet i en polymerbaserad pipett och observera kondenseringstillståndet var 5:e minut tills spermaprovet är helt flytande.
- Om spermaprovet inte har blivit helt flytande inom 30 minuter, utför inte undersökningen ännu. Fortsätt att vänta i ytterligare 30 minuter. Om sperman fortfarande inte är helt flytande efter 60 minuter, tillsätt en lika stor volym fosfatbuffertlösning för en utspädning på 1:1 och skaka försiktigt för att främja förvätskning.
- Efter noggrann omrörning och konsekvent homogenisering behålls det fullständigt flytande spermaprovet för de efterföljande undersökningsförfarandena.
3. Färgning av peroxidaspositiva leukocyter och analys av det ursprungliga spermaprovet
- Före provtagning, använd en polymerbaserad pipett för att upprepade gånger blåsa genom pipettering och homogenisera noggrant spermaprovet som undersöks.
- Använd 200 μL överföringspipett och justera skalan till 100 μL genom att vrida på ratten. Byt ut pipettspetsen och överför sedan 100 μL av spermaprovet till ett centrifugrör.
- Använd 1000 μL överföringspipett och justera skalan till 900 μL genom att vrida på ratten. Byt ut pipettspetsen och överför sedan 900 μL av ovan nämnda arbetslösning till centrifugröret.
- Blås upprepade gånger genom pipettering och homogenisera reaktanten, som består av spermaprovet och arbetslösningen, med hjälp av 1000 μL överföringspipett.
- Placera centrifugröret i ett provrörsställ på en tvådimensionell shaker och utsätt det för kontinuerlig omrörning vid 200 rpm i 30 min vid RT.
- I väntan på färgningsreaktionen, analysera spermaprovet med hjälp av CASA-systemet för att bestämma koncentrationen av spermier i det ursprungliga spermaprovet i det polymerbaserade kärlet.
- Slå på strömbrytaren på CASA-systemet och dubbelklicka på SCA SCOPE-ikonen för att öppna applikationsprogramvaran.
- Före provtagning, blås upprepade gånger genom pipettering och homogenisera noggrant det ursprungliga spermaprovet igen med en polymerbaserad pipett.
- Använd 10 μL överföringspipett och justera skalan till 10 μL genom att vrida på ratten. Sätt tillbaka pipettspetsen, pipettera upp 10 μL av det ursprungliga spermaprovet och placera det i SCA-räkningskammaren. Vänta i 60 s tills spermaprovet slutar driva.
- Placera SCA-räknekammaren på provhållaren i CASA-systemet och ställ in patientens information i dialogrutan i applikationsprogramvaran för att förbereda för den formella undersökningen.
- Undersök det ursprungliga spermaprovet i SCA-räkningskammaren med CASA-systemet genom att klicka på Start-knappen och registrera nödvändiga data, såsom koncentrationen av spermier.
4. Observation av peroxidaspositiva leukocyter och spermier
- Använd 1000 μL överföringspipett och justera skalan till 1000 μL genom att vrida på ratten. Byt ut pipettspetsen, blås sedan upprepade gånger genom pipettering och homogenisera reaktanten noggrant, som består av spermaprov och arbetslösning i centrifugröret igen i slutet av 30 minuters reaktionsprocess.
- Använd 10 μL överföringspipett och justera skalan till 10 μL genom att vrida på ratten. Sätt tillbaka pipettspetsen, pipettera upp 10 μL av reaktanten som nämns ovan och placera den i spermieräkningskammaren. Täck slutligen spermieräkningskammaren med ett särskilt glastäcke.
- Placera spermieräkningskammaren på mikroskopet stage och slå på strömbrytaren på det optiska mikroskopet med två 10x okular. Vänta sedan i 60 s tills reaktantprovet slutar driva.
- Byt den mikroskopiska omvandlaren till 10x objektivlinsen under väntetiden. Justera sedan grovjusteringsratten och finjusteringsratten i följd. Slutligen observerar spermierna och de runda cellerna under en förstoring på 10×10.
- Byt den mikroskopiska omvandlaren till 40x objektivlinsen efter att ha bestämt synfältet som ska analyseras och observera spermierna och de bruna peroxidaspositiva leukocyterna under en förstoring på 10 × 40.
- Använd det elektroniska räknarsystemet för att räkna minst 200 spermier och antalet bruna peroxidaspositiva leukocyter inom motsvarande fält.
5. Beräkning av koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter
- Beräkna koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter med hjälp av följande formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid implementering av ovannämnda procedur uppvisar reaktanten i centrifugröret ofta ett subgenomskinligt, opalskimrande utseende (figur 1). Att detektera en uppenbart brun färg avslöjar potentiell degranulering av leukocyter, vilket kan resultera i vätskefärgning. Följaktligen kan färgningsprocessen misslyckas, vilket gör det nödvändigt att antingen färga om eller samla in ett nytt spermaprov för omtestning21.
Peroxidaspositiva leukocyter uppvisade en brun nyans som kontrasterade mot de ofärgade vanliga runda cellerna (Figur 2, vanligt objektglas). Därefter räknades varje spermie och brun leukocyt i det nuvarande mikroskopfältet innan man övergick till ett helt nytt fält för kontinuerlig observation och räkning. För att säkerställa optimal noggrannhet är det nödvändigt att räkna minst 200 spermier och leukocyter som finns i motsvarande synfält.
Figur 1: Reaktantlösning. Reaktanten som fullbordar reaktionsprocessen är en subgenomskinlig opaliserande vätska. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Observation i optiskt mikroskop (vanligt objektglas). (A) Peroxidaspositiv leukocyt och (B) vanlig rundcell observerad vid optiskt mikroskop med 10 x 40 förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orto-toluidin och väteperoxid har ljuskänsliga egenskaper och kan sönderdelas när de utsätts för ljus. För att säkerställa testreagensernas effektivitet rekommenderas att den beredda arbetsvätskan förvaras på en mörk plats.
Spermaprover uppvisar naturligt heterogena egenskaper. I beredningsprocessen av spermaprover är det avgörande att korrekt bedöma spermans förvätskningstillstånd och noggrant homogenisera spermaproverna före varje provtagning för att förbättra testresultatens tillförlitlighet. Spermaproverna blir helt flytande inom 15 minuter. Mekanisk homogenisering eller enzymatisk nedbrytning bör övervägas om de inte har blivit helt flytande efter 60 minuter. Mer homogena spermaprover kan erhållas genom att försiktigt skaka provbehållaren kontinuerligt under förvätskningsprocessen med hjälp av en tvådimensionell shaker8.
Undersökningsmetoden som presenteras i denna uppsats har fördelarna med enkelhet, snabbhet och kostnadseffektivitet. Det kan dock inte vara fördelaktigt under vissa omständigheter: peroxidas lagras i azurofila granuler som kommer att utsöndras i det intercellulära utrymmet genom degranulering eller cytopempsis vid aktivering21,22. Följaktligen kan neutrofiler misslyckas med att färgas och kan inte identifieras. I sådana fall blir det nödvändigt att upprepa färgningsprocessen eller till och med kräva att patienten lämnar ett nytt spermaprov för ny undersökning. För att minimera denna situation rekommenderas att använda färska spermaprover när det är möjligt med minimal placeringstid och en skonsam homogeniseringsprocess. Denna metod kan endast identifiera aktiva sjukdomar eller infektioner och kan inte identifiera sjukdomar i senare stadier, såsom kroniska infektioner16. Dessutom utgör andra typer av leukocyter med lägre peroxidashalt, såsom lymfocyter, makrofager och monocyter, svårigheter att färga med denna metod; Därför kan man uppnå tillförlitliga resultat genom att använda leukocytantigen (t.ex. CD45) immunhistokemisk färgning.
Som krävs enligt den 5:e upplagan av WHO-manualen kräver traditionell positiv myeloperoxidasfärgning (Endtz-test) mikroskopisk räkning av minst 200 peroxidaspositiva leukocyter i en blodcellsräkningsplatta för att beräkna deras koncentration8. Jämfört med det traditionella manuella Endtz-testet introducerar detta protokoll spermiekoncentrationsdata som erhållits genom CASA-detektion, genom att kombinera manuella och automatiska metoder. För att beräkna koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter räknades minst 200 spermier och leukocyter i motsvarande synfält i mikroskop. Eftersom koncentrationen av spermier i sädesvätskan är mycket högre än i leukocyter krävdes mindre tid för att räkna 200 spermier jämfört med att räkna 200 peroxidaspositiva leukocyter.
Patienter med svår oligospermi, kryptozoospermi och azoospermi har ofta svårt att räkna tillräckligt många spermier. I sådana fall kan koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter beräknas direkt med hjälp av en blodcellsräkningsplatta enligt beskrivningen i manualen för plattan. Dessutom, för patienter som inte behöver CASA eller laboratorier utan CASA-utrustning, kan en blodcellsräkningsplatta också användas för att bestämma koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma mot andrologilaboratoriet vid Center for Reproductive Medicine, det tredje anslutna sjukhuset vid Sun Yat-sen University, för att ha tillhandahållit faciliteterna för denna studie. Ingen finansiering var inblandad i utarbetandet av denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L.
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J.
