Summary
Dit artikel presenteert een economisch en efficiënt protocol voor het onderzoeken van peroxidase-positieve leukocyten in sperma. Met behulp van een computerondersteund sperma-analysesysteem (CASA) kan de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten in sperma binnen een totaal van 60 minuten worden verkregen, waardoor de efficiëntie van andrologielaboratoria en andrologen effectief wordt verbeterd.
Abstract
Leukocytospermie kan leiden tot verminderde beweeglijkheid van de spermatozoa, verhoogde morfologische afwijkingen van de spermatozoa, verhoogde DNA-fragmentatie-index van de spermatozoa, verslechtering van de acrosoomfunctie van de spermatozoa en zelfs tot een verminderde embryonale ontwikkeling. Het is een veel voorkomende andrologische ziekte in de klinische praktijk en een van de belangrijke oorzaken van mannelijke onvruchtbaarheid. Bij het bepalen of er sprake is van ontsteking van het mannelijke voortplantingsstelsel, kiezen andrologen er vaak voor om ronde cellen of zaadplasma-elastase in het sperma te onderzoeken als klinische diagnostische basis. Het onderzoek van ronde cellen wordt echter gemakkelijk beïnvloed door afgestoten spermatogene cellen en epitheelcellen van het voortplantingsstelsel, die niet bijdragen aan het verminderen van het willekeurige en onnodige gebruik van antibiotica. Tegelijkertijd is het detectieproces van elastase relatief ingewikkeld, tijdrovend en traag in het rapporteren van resultaten, wat niet gunstig is voor vroege diagnose en behandeling van ziekten zoals infecties van de mannelijke geslachtsorganen (MGTI's). We hebben het onderzoek van peroxidase-positieve leukocyten in sperma, ondersteund door een computerondersteund sperma-analysesysteem (CASA), op innovatieve wijze toegepast als diagnostisch criterium voor leukocytospermie, waardoor deze problemen met succes zijn opgelost. Dit onderzoek vereist alleen de toevoeging van de bedrijfsvloeistof bestaande uit vier reagentia aan het monster, en de totale reactietijd bij kamertemperatuur kan binnen 20-30 minuten worden geregeld. Met het daaropvolgende uitstrijkje en microscopisch onderzoek kan de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten in sperma worden verkregen binnen een totaal van 60 minuten, die kan worden gebruikt om te diagnosticeren of de ontsteking van het mannelijke voortplantingsstelsel bestond.
Introduction
Onvruchtbaarheid is naar voren gekomen als een wereldwijd probleem voor de volksgezondheid dat ongeveer 15% van de paren in hun vruchtbare leeftijd treft. Mannelijke factoren worden bijgedragen door ongeveer 50% van de totale gevallen van subfertiliteit, en bijna 20% tot 30% kan uitsluitend worden toegeschreven aan mannelijke factoren 1,2,3. Infecties van de mannelijke geslachtsorganen (MGTI's) vormen een van de belangrijkste oorzaken van mannelijke onvruchtbaarheid, goed voor ongeveer 15% van de gevallen 4,5.
De meeste mensen hebben leukocyten in hun sperma, die 13% van de niet-spermatozoaire cellen uitmaken, met differentiële verhoudingen als neutrofielen 12%, macrofagen 0,9% en lymfocyten 0,1%6,7. Volgens de laboratoriumhandleiding van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor het onderzoek en de verwerking van menselijk sperma (5e ed.) wordt leukocytospermie meestal gedefinieerd als de aanwezigheid van >1 × 106 cellen/ml leukocyten in sperma8. Deze aandoening kan worden veroorzaakt door tal van factoren, zoals milieutoxines, middelenmisbruik, varicoceles, MGTI's, enz., die allemaal kunnen leiden tot een abnormale toename van de leukocytenconcentratie in sperma9. Leukocyten kunnen de niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in sperma verhogen, wat lipideperoxidatie en oxidatieve schade aan eiwitten en DNA veroorzaakt, wat resulteert in verminderde beweeglijkheid van de spermatozoa, verhoogde morfologische afwijkingen van de spermatozoa, verhoogde DNA-fragmentatie-index van de spermatozoa, verslechtering van de acrosoomfunctie van de spermatozoa en zelfs negatieve effecten op de ontwikkeling van het embryo10,11.
Momenteel kiezen andrologen er vaak voor om ronde cellen in sperma of elastase in zaadplasma te onderzoeken bij het identificeren van ontsteking van de geslachtsorganen. Het is echter vaak een uitdaging om onderscheid te maken tussen afgespoelde spermatogene cellen en epitheelcellen van het voortplantingsstelsel, die niet bijdragen aan het verminderen van het willekeurige en onnodige gebruik van antibiotica6. De laatste onderzoeksmethode is relatief ingewikkeld en tijdrovend, met trage rapportage van resultaten, wat niet gunstig is voor een vroege diagnose en behandeling van ziekten zoals MGTI's. De American Urological Association (AUA) stelt voor om verder onderscheid te maken tussen leukocyten en afgespoelde cellen uit het geslachtsorgaan wanneer de ronde celconcentratie in sperma-analyse groter is dan 1 × 106 cellen/ml12. Sommige andrologielaboratoria gebruiken flowcytometrie13 of leukocytenantigeen (bijv. CD45) immunocytochemie14 om leukocyten te onderzoeken. Hoewel deze methoden nauwkeurig zijn, zijn ze duur en tijdrovend, waardoor grootschalige klinische implementatie moeilijk is, vooral in ontwikkelingslanden.
Peroxidase is wijd verspreid in verschillende soorten cellen en speelt een cruciale rol bij de weerstand tegen oxidatieve stressschade. Myeloperoxidase (MPO) is een lid van de peroxidase-subfamilie die over het algemeen tot expressie komt in immuuncellen. Het komt het sterkst tot expressie in de azurofiele korrelsvan neutrofielen 15,16 en komt ook tot expressie in lymfocyten17,18, monocyten en macrofagen19. De concentratie van leukocyten, vooral neutrofielen, in sperma kan worden verkregen door ronde cellen te onderzoeken die peroxidase-positiefzijn 7,20. Om het onderzoeksproces van leukocyten in sperma economisch, gemakkelijk en efficiënt te maken, hebben we de onderzoeksmethode opnieuw ontworpen. Met behulp van het computerondersteunde sperma-analysesysteem (CASA) kan de concentratie leukocyten binnen 60 minuten worden verkregen. Deze nieuwe methode verlaagt de onderzoekskosten van de patiënt en de wachttijd voor het verkrijgen van resultaten, verlicht de werklast van laboranten en verkort de wachttijd voor de diagnose en behandeling van de arts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie is beoordeeld en goedgekeurd door de Medisch-Ethische Commissie van The Third Affiliated Hospital van Sun Yat-sen University.
1. Bereiding van de werkoplossing
- Verzamel de volgende reagentia die essentieel zijn voor het bereiden van de werkoplossing: ortho-toluïdine substraatoplossing, verzadigde ammoniumchloride (NH4Cl) oplossing, 148 mmol/L ethyleendiaminetetra-azijnzuurdinatriumzout (Na2EDTA) oplossing en 6% (v/v) waterstofperoxide-oplossing. Plaats ze op een laboratoriumtafel op kamertemperatuur (RT), samen met het benodigde gereedschap, zoals transferpipetten (1000 μL, 200 μL, 10 μL) en reageerbuisrekken.
LET OP: Lees het veiligheidsinformatieblad (SDS) voordat u de bovengenoemde reagentia hanteert. - Maak een ondoorzichtige bruine reagensfles klaar om de bereide werkoplossing te bewaren en te beschermen tegen blootstelling aan licht.
- Breng de reagentia over in de ondoorzichtige bruine reagensfles volgens de onderstaande verhoudingen:
- Gebruik de overdrachtspipet van 200 μl en stel de schaal in op 100 μl door aan de knop te draaien. Breng vervolgens 100 μL van de NH4Cl-oplossing over in de ondoorzichtige bruine reagensfles.
- Plaats de pipetpunt terug en breng 100 μl van de 148 mmol/L Na2EDTA-oplossing over in de ondoorzichtige bruine reagensfles met behulp van de hierboven genoemde 200 μl overdrachtspipet. Blaas vervolgens voorzichtig door te pipetteren en homogeniseer de oplossing grondig.
- Gebruik de overdrachtspipet van 1000 μL en stel de schaal in op 900 μL door aan de knop te draaien. Breng vervolgens 900 μL van de ortho-toluïdine substraatoplossing over in de ondoorzichtige bruine reagensfles, blaas voorzichtig door te pipetteren en homogeniseer de oplossing grondig.
- Gebruik de overdrachtspipet van 10 μl en stel de schaal in op 5 μl door aan de knop te draaien. Breng vervolgens 5 μL van de 6% (v/v) waterstofperoxide-oplossing over in de ondoorzichtige bruine reagensfles.
- Gebruik de overdrachtspipet van 1000 μl en stel de schaal in op 1000 μl door aan de knop te draaien. Plaats de pipetpunt terug, blaas voorzichtig door te pipetteren en homogeniseer de oplossing grondig in de ondoorzichtige bruine reagensfles.
- Bewaar de kant-en-klare werkoplossing in de ondoorzichtige bruine reagensfles bij RT, uit de buurt van licht. De werkoplossing is 24 uur reactief.
- Voor elk spermamonster is 900 μL van de werkoplossing nodig. Zorg ervoor dat de hoeveelheid van de werkoplossing die elke dag wordt bereid, overeenstemt met het aantal monsters dat dagelijks wordt onderzocht.
2. Bereiding van het spermamonster
- Voordat u het spermamonster verzamelt, moet u ervoor zorgen dat de patiënt zich gedurende 2 tot 7 dagen heeft onthouden van ejaculatie, zoals vereist door de laboratoriumhandleiding van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor het onderzoeken en verwerken van menselijk sperma (5e ed.) 8. Masturbatie is de voorkeursmethode voor het verkrijgen van spermamonsters. Om de nauwkeurigheid van het onderzoek te verbeteren, instrueert u de patiënt om al het geëjaculeerde sperma te verzamelen.
- Zet de standaard met constante temperatuur aan en verwarm van tevoren tot 37 °C, zodat de daaropvolgende liquefactie van het spermamonster soepel kan verlopen.
- Noteer na ontvangst van het spermamonster van de patiënt nauwgezet gedetailleerde informatie, inclusief identificatiecode, verzameltijd, onthoudingsduur en andere relevante informatie, op de buitenwand van de op polymeer gebaseerde houder.
- Plaats de op polymeer gebaseerde recipiënt waarin het spermamonster is ondergebracht op de standaard met constante temperatuur, voorverwarmd tot 37 °C, wat gunstig is voor het vloeibaar maken van het sperma.
- Zuig het spermamonster in een pipet op polymeerbasis en observeer de toestand van liquefactie elke 5 minuten totdat het spermamonster volledig vloeibaar is.
- Als het spermamonster niet binnen 30 minuten volledig vloeibaar is gemaakt, voer het onderzoek dan nog niet uit; Blijf nog 30 minuten wachten. Als het sperma na 60 minuten nog steeds niet volledig vloeibaar is, voeg dan een gelijk volume fosfaatbufferoplossing toe voor een verdunning van 1:1 en schud voorzichtig om de vloeibaarmaking te bevorderen.
- Bewaar na grondig roeren en consequent homogeniseren het volledig vloeibaar gemaakte spermamonster voor de volgende onderzoeksprocedures.
3. Kleuring van de peroxidase-positieve leukocyten en analyse van het originele spermamonster
- Gebruik voorafgaand aan de bemonstering een pipet op basis van polymeren om herhaaldelijk te blazen door te pipetteren en het te onderzoeken spermamonster grondig te homogeniseren.
- Gebruik de overdrachtspipet van 200 μl en stel de schaal in op 100 μl door aan de knop te draaien. Plaats de pipetpunt terug en breng vervolgens 100 μl van het spermamonster over in een centrifugebuis.
- Gebruik de overdrachtspipet van 1000 μL en stel de schaal in op 900 μL door aan de knop te draaien. Plaats de pipetpunt terug en breng vervolgens 900 μL van de bovengenoemde werkoplossing over in de centrifugebuis.
- Blaas herhaaldelijk door te pipetteren en homogeniseer de reactant, die bestaat uit het spermamonster en de werkoplossing, grondig met behulp van de 1000 μL transferpipet.
- Plaats de centrifugebuis in een reageerbuisrek op een tweedimensionale schudder en stel deze gedurende 30 minuten bij RT continu in beweging bij 200 tpm.
- Terwijl u wacht op de kleuringsreactie, analyseert u het spermamonster met behulp van het CASA-systeem om de concentratie spermatozoa in het oorspronkelijke spermamonster in de op polymeer gebaseerde houder te bepalen.
- Zet de aan/uit-schakelaar van het CASA-systeem aan en dubbelklik op het SCA SCOPE-pictogram om de toepassingssoftware te openen.
- Blaas vóór het nemen van monsters herhaaldelijk door te pipetteren en homogeniseer het oorspronkelijke spermamonster opnieuw grondig met een pipet op polymeerbasis.
- Gebruik de overdrachtspipet van 10 μl en stel de schaal in op 10 μl door aan de knop te draaien. Plaats de pipetpunt terug, pipetteer 10 μl van het oorspronkelijke spermamonster en plaats het in de SCA-telkamer. Wacht 60 seconden totdat het spermamonster stopt met drijven.
- Plaats de SCA-telkamer op de monsterhouder van het CASA-systeem en stel de patiëntinformatie in het dialoogvenster van de applicatiesoftware in om zich voor te bereiden op het formele onderzoek.
- Onderzoek het originele spermamonster in de SCA-telkamer met het CASA-systeem door op de Start-knop te klikken en noteer de benodigde gegevens, zoals de concentratie spermatozoa.
4. Observatie van de peroxidase-positieve leukocyten en spermatozoa
- Gebruik de overdrachtspipet van 1000 μl en stel de schaal in op 1000 μl door aan de knop te draaien. Plaats de pipetpunt terug, blaas vervolgens herhaaldelijk door te pipetteren en homogeniseer de reactant, die bestaat uit spermamonster en werkoplossing opnieuw in de centrifugebuis aan het einde van het reactieproces van 30 minuten.
- Gebruik de overdrachtspipet van 10 μl en stel de schaal in op 10 μl door aan de knop te draaien. Plaats de pipetpunt terug, pipetteer 10 μL van de bovengenoemde reactant en plaats deze in de spermatelkamer. Bedek ten slotte de kamer voor het tellen van sperma met een speciaal glazen dekglaasje.
- Plaats de kamer voor het tellen van spermacellen op de microscopische tafel en zet de aan/uit-schakelaar van de optische microscoop met twee 10x oculairs aan. Wacht vervolgens 60 seconden totdat het reactantmonster stopt met afdrijven.
- Schakel de microscopische converter tijdens de wachttijd over op de 10x objectieflens. Stel vervolgens de grofafstelknop en de fijnafstellingsknop achtereenvolgens in. Observeer ten slotte de spermatozoa en ronde cellen onder een vergroting van 10×10.
- Schakel de microscopische converter over naar de 40x objectieflens na het bepalen van het te analyseren gezichtsveld en observeer de spermatozoa en bruine peroxidase-positieve leukocyten onder een vergroting van 10 × 40.
- Gebruik het elektronische tellersysteem om ten minste 200 spermatozoa en het aantal bruine peroxidase-positieve leukocyten binnen de overeenkomstige velden te tellen.
5. Berekening van de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten
- Bereken de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten met behulp van de volgende formule:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij het toepassen van de bovengenoemde procedure vertoont de reactant in de centrifugebuis vaak een subdoorschijnend, opaalachtig uiterlijk (Figuur 1). Het detecteren van een duidelijk bruine kleur onthult mogelijke degranulatie van leukocyten, wat kan leiden tot vloeistofkleuring. Bijgevolg kan het kleuringsproces mislukken, waardoor het nodig wordt om opnieuw te kleuren of een nieuw spermamonster te verzamelen om opnieuw te testen21.
Peroxidase-positieve leukocyten vertoonden een bruine tint, in contrast met de ongekleurde gewone ronde cellen (Figuur 2, gewoon objectglaasje). Vervolgens werd elke spermatozoön en bruine leukocyt onder het huidige microscoopveld geteld voordat ze overschakelden naar een geheel nieuw veld voor continue observatie en telling. Om een optimale nauwkeurigheid te garanderen, is het noodzakelijk om minimaal 200 spermatozoa en de leukocyten in het overeenkomstige gezichtsveld te tellen.
Figuur 1: Reactantoplossing. De reactant die het reactieproces voltooit, is een subdoorschijnende opaalachtige vloeistof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Waarneming onder optische microscoop (gewoon objectglaasje). (A) Peroxidase-positieve leukocyten en (B) gewone ronde cellen waargenomen bij een optische microscoop met een vergroting van 10 x 40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ortho-toluïdine en waterstofperoxide hebben lichtgevoelige eigenschappen en kunnen ontleden bij blootstelling aan licht. Om de doeltreffendheid van de testreagentia te garanderen, wordt aanbevolen de bereide werkvloeistof op een donkere plaats te bewaren.
Spermamonsters vertonen van nature heterogene kenmerken. Bij de bereiding van spermamonsters is het correct beoordelen van de vloeibaarmakingstoestand van sperma en het grondig homogeniseren van de spermamonsters vóór elke bemonstering van cruciaal belang om de betrouwbaarheid van de testresultaten te verbeteren. Spermamonsters worden binnen 15 minuten volledig vloeibaar. Mechanische homogenisatie of enzymatische vertering moet worden overwogen als ze na 60 minuten nog niet volledig vloeibaar zijn geworden. Meer homogene spermamonsters kunnen worden verkregen door de monstercontainer tijdens het vloeibaarmakingsproces voorzichtig continu te schudden met behulp van een tweedimensionale shaker8.
De onderzoeksmethode die in dit artikel wordt gepresenteerd, heeft de voordelen van eenvoud, snelheid en kosteneffectiviteit. Onder bepaalde omstandigheden kan het echter niet voordelig zijn: peroxidase wordt opgeslagen in azurofiele korrels die bij activering in de intercellulaire ruimte worden uitgescheiden door degranulatie of cytopempsis 21,22. Bijgevolg kunnen neutrofielen niet verkleuren en niet worden geïdentificeerd. In dergelijke gevallen wordt het noodzakelijk om het kleuringsproces te herhalen of zelfs van de patiënt te eisen dat hij een nieuw spermamonster afgeeft voor heronderzoek. Om deze situatie tot een minimum te beperken, wordt aanbevolen om waar mogelijk verse spermamonsters te gebruiken met een minimale plaatsingstijd en een zacht homogenisatieproces. Deze methode kan alleen actieve ziekten of infecties identificeren en kan geen ziekten in latere stadia identificeren, zoals chronischeinfecties16. Bovendien vormen andere soorten leukocyten met een lager peroxidasegehalte, zoals lymfocyten, macrofagen en monocyten, problemen bij het kleuren met deze methode; daarom kunnen betrouwbare resultaten worden verkregen door gebruik te maken van immunohistochemische kleuring van leukocytenantigeen (bijv. CD45).
Zoals vereist door de 5e editie van het WHO-handboek, vereist traditionele positieve myeloperoxidasekleuring (Endtz-test) microscopische telling van ten minste 200 peroxidase-positieve leukocyten in een bloedcelgetalplaatje om hun concentratiete berekenen 8. In vergelijking met de traditionele handmatige Endtz-test introduceert dit protocol de gegevens over de spermatozoa-concentratie die zijn verkregen door CASA-detectie, waarbij handmatige en automatische methoden worden gecombineerd. Om de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten te berekenen, werden ten minste 200 spermatozoa en leukocyten in het overeenkomstige gezichtsveld onder een microscoop geteld. Aangezien de concentratie van spermatozoa in sperma veel groter is dan die van leukocyten, was er minder tijd nodig om 200 spermatozoa te tellen in vergelijking met het tellen van 200 peroxidase-positieve leukocyten.
Patiënten met ernstige oligospermie, cryptozoöspermie en azoöspermie worden vaak geconfronteerd met uitdagingen bij het tellen van een voldoende aantal spermatozoa. In dergelijke gevallen kan de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten direct worden berekend met behulp van een bloedceltelplaat zoals beschreven in de handleiding van de plaat. Bovendien kan voor patiënten die geen CASA nodig hebben of laboratoria zonder CASA-apparatuur, ook een bloedceltelplaat worden gebruikt om de concentratie peroxidase-positieve leukocyten te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn het Andrologielaboratorium van het Center for Reproductive Medicine, het derde aangesloten ziekenhuis van de Sun Yat-sen University, dankbaar voor het verstrekken van de faciliteiten voor deze studie. Bij de voorbereiding van dit artikel was geen financiering betrokken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L.
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J.
