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Medicine

वीर्य में पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की परीक्षा

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66211
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Center for Reproductive Medicine, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University
* These authors contributed equally

Summary

यह पत्र वीर्य में पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की जांच के लिए एक किफायती और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। कंप्यूटर सहायता प्राप्त वीर्य विश्लेषण (CASA) प्रणाली की सहायता से, वीर्य में पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की एकाग्रता कुल 60 मिनट के भीतर प्राप्त की जा सकती है, प्रभावी रूप से एंड्रोलॉजी प्रयोगशाला और एंड्रोलॉजिस्ट की दक्षता में सुधार करती है।

Abstract

ल्यूकोसाइटोस्पर्मिया से शुक्राणुजोज़ा गतिशीलता में कमी आ सकती है, शुक्राणुजोज़ा रूपात्मक असामान्यताएं, ऊंचा शुक्राणुजोज़ा डीएनए विखंडन सूचकांक, शुक्राणुजोज़ा एक्रोसोम फ़ंक्शन की हानि, और यहां तक कि भ्रूण के विकास को भी प्रभावित किया जा सकता है। यह नैदानिक अभ्यास में एक आम एंड्रोलॉजिकल बीमारी है और पुरुष बांझपन के महत्वपूर्ण कारणों में से एक है। यह निर्धारित करते समय कि क्या पुरुष प्रजनन पथ की सूजन मौजूद है, एंड्रोलॉजिस्ट अक्सर नैदानिक नैदानिक आधार के रूप में वीर्य में गोल कोशिकाओं या सेमिनल प्लाज्मा इलास्टेस की जांच करना चुनते हैं। हालांकि, गोल कोशिकाओं की परीक्षा आसानी से सुस्त शुक्राणुजन्य कोशिकाओं और प्रजनन पथ उपकला कोशिकाओं से प्रभावित होती है, जो एंटीबायोटिक दवाओं के अंधाधुंध और अनावश्यक उपयोग को कम करने में योगदान नहीं करती हैं। इसी समय, इलास्टेस की पहचान प्रक्रिया अपेक्षाकृत जटिल, समय लेने वाली और रिपोर्टिंग परिणामों में धीमी है, जो पुरुष जननांग पथ के संक्रमण (एमजीटीआई) जैसी बीमारियों के शुरुआती निदान और उपचार के लिए फायदेमंद नहीं है। हमने ल्यूकोसाइटोस्पर्मिया के लिए नैदानिक मानदंड के रूप में कंप्यूटर-सहायता प्राप्त वीर्य विश्लेषण (सीएएसए) प्रणाली द्वारा सहायता प्राप्त वीर्य में पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की परीक्षा को अभिनव रूप से लागू किया है, इन समस्याओं को सफलतापूर्वक हल किया है। इस परीक्षा में केवल नमूना में चार अभिकर्मकों से मिलकर ऑपरेटिंग तरल पदार्थ के अलावा की आवश्यकता है, और कमरे के तापमान पर कुल प्रतिक्रिया समय 20-30 मिनट के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है. बाद के धब्बा और सूक्ष्म परीक्षा के साथ, वीर्य में पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की एकाग्रता कुल 60 मिनट के भीतर प्राप्त की जा सकती है, जिसका उपयोग यह निदान करने के लिए किया जा सकता है कि पुरुष प्रजनन पथ की सूजन मौजूद है या नहीं।

Introduction

बांझपन एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दे के रूप में उभरा है जो लगभग 15% जोड़ों को उनकी प्रजनन आयु में प्रभावित करता है। पुरुष कारकों का योगदान कुल सबफर्टिलिटी मामलों का लगभग 50% होता है, और लगभग 20% से 30% को पूरी तरह से पुरुष कारकों 1,2,3 के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। पुरुष जननांग पथ के संक्रमण (एमजीटीआई) पुरुष बांझपन के महत्वपूर्ण कारणों में से एक है, जो लगभग 15% मामलोंमें 4,5 के लिए जिम्मेदार है।

अधिकांश व्यक्तियों के वीर्य में ल्यूकोसाइट्स होते हैं, जो गैर-शुक्राणुजोज़ा कोशिकाओं का 13% बनाते हैं, जिसमें अंतर अनुपात न्यूट्रोफिल 12%, मैक्रोफेज 0.9%, और लिम्फोसाइट्स 0.1% 6,7 होते हैं। मानव वीर्य (5 वें संस्करण) की परीक्षा और प्रसंस्करण के लिए विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) प्रयोगशाला मैनुअल के अनुसार, ल्यूकोसाइटोस्पर्मिया को आमतौर पर वीर्य8 में >1 × 106 कोशिकाओं / यह स्थिति पर्यावरण विषाक्त पदार्थों, मादक द्रव्यों के सेवन, वैरिकोसेलेस, एमजीटीआई इत्यादि जैसे कई कारकों के कारण हो सकती है, जो सभी संभावित रूप से वीर्य9 में ल्यूकोसाइट एकाग्रता में असामान्य वृद्धि का कारण बनती हैं। ल्यूकोसाइट्स वीर्य में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर को बढ़ा सकते हैं, जिससे लिपिड पेरोक्सीडेशन और प्रोटीन और डीएनए को ऑक्सीडेटिव क्षति होती है, जिसके परिणामस्वरूप शुक्राणुजोज़ा गतिशीलता में कमी आती है, शुक्राणुजोज़ा रूपात्मक असामान्यताएं, ऊंचा शुक्राणुजोज़ा डीएनए विखंडन सूचकांक, शुक्राणुजोज़ा एक्रोसोम फ़ंक्शन की हानि, और भ्रूण के विकास पर भी नकारात्मक प्रभाव10,11.

वर्तमान में, एंड्रोलॉजिस्ट आमतौर पर जननांग पथ की सूजन की पहचान करते समय वीर्य या सेमिनल प्लाज्मा में इलास्टेस में गोल कोशिकाओं की जांच करना चुनते हैं। हालांकि, स्लॉग्ड स्पर्मेटोजेनिक कोशिकाओं और प्रजनन पथ उपकला कोशिकाओं को अलग करना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है, जो एंटीबायोटिक दवाओं के अंधाधुंध और अनावश्यक उपयोग को कम करने में योगदाननहीं करते हैं। बाद की परीक्षा विधि अपेक्षाकृत जटिल और समय लेने वाली है, धीमी परिणाम रिपोर्टिंग के साथ, जो एमजीटीआई जैसी बीमारियों के शुरुआती निदान और उपचार के लिए फायदेमंद नहीं है। अमेरिकन यूरोलॉजिकल एसोसिएशन (एयूए) का सुझाव है कि जननांग पथ से ल्यूकोसाइट्स और स्लॉड कोशिकाओं के बीच और भेदभाव किया जाना चाहिए जब वीर्य विश्लेषण में गोल सेल एकाग्रता 1 × 106 कोशिकाओं / एमएल12 से अधिक हो। कुछ एंड्रोलॉजी प्रयोगशालाएं ल्यूकोसाइट्स की जांच करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री13 या ल्यूकोसाइट एंटीजन (जैसे, सीडी 45) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री14 का उपयोग करती हैं। हालांकि ये विधियां सटीक हैं, वे महंगे और समय लेने वाली हैं, जिससे बड़े पैमाने पर नैदानिक कार्यान्वयन मुश्किल हो जाता है, खासकर विकासशील देशों में।

पेरोक्सीडेज व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में वितरित किया जाता है और ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति के प्रतिरोध में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ) पेरोक्सीडेज उपपरिवार का एक सदस्य है जो आमतौर पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। यह सबसे अधिक न्यूट्रोफिल 'azurophilic granules15,16 में व्यक्त की है और यह भी लिम्फोसाइटों17,18, monocytes, और मैक्रोफेज19 में व्यक्त की है. वीर्य में ल्यूकोसाइट्स, विशेष रूप से न्यूट्रोफिल की एकाग्रता, गोल कोशिकाओं की जांच करके प्राप्त की जा सकती है जो पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव 7,20 हैं। वीर्य में ल्यूकोसाइट्स की परीक्षा प्रक्रिया को किफायती, सुविधाजनक और कुशल बनाने के लिए, हमने परीक्षा पद्धति को फिर से तैयार किया। कंप्यूटर सहायता प्राप्त वीर्य विश्लेषण (CASA) प्रणाली द्वारा सहायता प्राप्त, ल्यूकोसाइट्स की एकाग्रता 60 मिनट के भीतर प्राप्त की जा सकती है। यह नई विधि रोगियों की परीक्षा लागत और परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रतीक्षा समय को कम करती है, प्रयोगशाला तकनीशियनों के कार्यभार को कम करती है, और डॉक्टर के निदान और उपचार की प्रतीक्षा अवधि को कम करती है।

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Protocol

इस अध्ययन की समीक्षा की गई है और सन यात-सेन विश्वविद्यालय के तीसरे संबद्ध अस्पताल की मेडिकल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. कार्य समाधान की तैयारी

  1. कार्यशील समाधान तैयार करने के लिए आवश्यक निम्नलिखित अभिकर्मकों को इकट्ठा करें- ऑर्थो-टोल्यूडीन सब्सट्रेट समाधान, संतृप्त अमोनियम क्लोराइड (NH4Cl) समाधान, 148 mmol / L एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड डिसोडियम नमक (Na2EDTA) समाधान, और 6% (v/v) हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान। उन्हें आवश्यक उपकरणों के साथ कमरे के तापमान (आरटी) लैब बेंच पर रखें, जैसे ट्रांसफर पिपेट (1000 माइक्रोन, 200 माइक्रोन, 10 माइक्रोन) और टेस्ट ट्यूब रैक।
    चेतावनी: उपर्युक्त अभिकर्मकों को संभालने से पहले सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) पढ़ें।
  2. तैयार काम करने वाले समाधान को प्रकाश के संपर्क में रखने और बचाने के लिए एक अपारदर्शी भूरे रंग की अभिकर्मक बोतल तैयार करें।
  3. अभिकर्मकों को नीचे निर्दिष्ट अनुपात के अनुसार अपारदर्शी भूरे रंग की अभिकर्मक बोतल में स्थानांतरित करें:
    1. 200 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और घुंडी को घुमाकर पैमाने को 100 माइक्रोन तक समायोजित करें। फिर, एनएच4सीएल समाधान के 100 माइक्रोन को अपारदर्शी भूरे रंग की अभिकर्मक बोतल में स्थानांतरित करें।
    2. पिपेट टिप को बदलें और ऊपर उल्लिखित 200 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके अपारदर्शी भूरे रंग के अभिकर्मक बोतल में 148 मिमीलो / एल ना2ईडीटीए समाधान के 100 माइक्रोन को स्थानांतरित करें। फिर, धीरे से पाइपिंग द्वारा उड़ाएं और समाधान को अच्छी तरह से समरूप करें।
    3. 1000 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और घुंडी को घुमाकर पैमाने को 900 माइक्रोन तक समायोजित करें। फिर, ऑर्थो-टोलुइडीन सब्सट्रेट समाधान के 900 माइक्रोन को अपारदर्शी भूरे रंग की अभिकर्मक बोतल में स्थानांतरित करें, धीरे से पाइपिंग द्वारा उड़ाएं, और समाधान को अच्छी तरह से समरूप करें।
    4. 10 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और नॉब को घुमाकर स्केल को 5 माइक्रोन तक समायोजित करें। फिर, 6% (v/v) हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के 5 माइक्रोन को अपारदर्शी भूरे रंग की अभिकर्मक बोतल में स्थानांतरित करें।
  4. 1000 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और घुंडी को घुमाकर पैमाने को 1000 माइक्रोन तक समायोजित करें। विंदुक टिप बदलें, धीरे pipetting द्वारा उड़ा, और अच्छी तरह से अपारदर्शी भूरे रंग अभिकर्मक बोतल में समाधान homogenize.
  5. प्रकाश से दूर, आरटी पर अपारदर्शी भूरे रंग के अभिकर्मक बोतल में उपयोग के लिए तैयार काम करने वाले समाधान को स्टोर करें। काम कर रहे समाधान 24 घंटे के लिए प्रतिक्रियाशील है।
  6. प्रत्येक वीर्य के नमूने को काम करने वाले समाधान के 900 माइक्रोन की आवश्यकता होती है। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक दिन तैयार किए गए कार्य समाधान की मात्रा दैनिक जांच किए गए नमूनों की संख्या से मेल खाती है।

2. वीर्य का नमूना तैयार करना

  1. वीर्य का नमूना एकत्र करने से पहले, सुनिश्चित करें कि रोगी ने मानव वीर्य की जांच और प्रसंस्करण के लिए विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) प्रयोगशाला मैनुअल द्वारा आवश्यक 2 से 7 दिनों के लिए स्खलन से परहेज किया है (5 वां संस्करण। 8. वीर्य के नमूने प्राप्त करने के लिए हस्तमैथुन पसंदीदा तरीका है। परीक्षा की सटीकता में सुधार करने के लिए, रोगी को सभी स्खलित वीर्य एकत्र करने का निर्देश दें।
  2. निरंतर तापमान स्टैंड चालू करें और अग्रिम में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें ताकि वीर्य के नमूने के बाद के द्रवीकरण आसानी से आगे बढ़ सकें।
  3. रोगी के वीर्य का नमूना प्राप्त होने पर, बहुलक-आधारित ग्रहण की बाहरी दीवार पर पहचान कोड, संग्रह समय, संयम अवधि और अन्य प्रासंगिक जानकारी सहित विस्तृत जानकारी को सावधानीपूर्वक रिकॉर्ड करें।
  4. निरंतर तापमान स्टैंड पर वीर्य के नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने वाले बहुलक-आधारित पात्र को रखें, जो वीर्य द्रवीकरण के लिए फायदेमंद है।
  5. वीर्य का नमूना एक बहुलक आधारित विंदुक में ड्रा और वीर्य नमूना पूरी तरह से तरलीकृत है जब तक हर 5 मिनट द्रवीकरण की स्थिति का निरीक्षण.
  6. वीर्य का नमूना 30 मिनट के भीतर पूरी तरह से तरलीकृत नहीं किया गया है, तो अभी तक परीक्षा न करें; एक और 30 मिनट के लिए इंतजार करना जारी रखें। वीर्य अभी भी 60 मिनट के बाद पूरी तरह से तरलीकृत नहीं है, तो एक 1:1 कमजोर पड़ने के लिए फॉस्फेट बफर समाधान के बराबर मात्रा जोड़ें और धीरे द्रवीकरण को बढ़ावा देने के लिए आंदोलन.
  7. पूरी तरह से आंदोलन और लगातार homogenizing के बाद, बाद की परीक्षा प्रक्रियाओं के लिए पूरी तरह से तरलीकृत वीर्य नमूना बनाए रखने.

3. पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स का धुंधला होना और मूल वीर्य नमूने का विश्लेषण करना

  1. नमूना लेने से पहले, एक बहुलक आधारित विंदुक का उपयोग करने के लिए बार-बार pipetting द्वारा उड़ा और अच्छी तरह से परीक्षा के तहत वीर्य नमूना homogenize.
  2. 200 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और घुंडी को घुमाकर पैमाने को 100 माइक्रोन तक समायोजित करें। विंदुक टिप बदलें, और फिर वीर्य के नमूने के 100 माइक्रोन को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 1000 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और घुंडी को घुमाकर पैमाने को 900 माइक्रोन तक समायोजित करें। पिपेट टिप को बदलें, फिर अपकेंद्रित्र ट्यूब में उपर्युक्त कामकाजी समाधान के 900 माइक्रोन को स्थानांतरित करें।
  4. बार-बार पिपेट करके उड़ाएं और अभिकारक को अच्छी तरह से समरूप करें, जिसमें वीर्य का नमूना और काम करने वाला समाधान होता है, जिसमें 1000 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग किया जाता है।
  5. अपकेंद्रित्र ट्यूब को दो आयामी शेकर पर टेस्ट-ट्यूब रैक में रखें और इसे आरटी पर 30 मिनट के लिए 200 आरपीएम पर निरंतर आंदोलन के अधीन करें।
  6. धुंधला प्रतिक्रिया की प्रतीक्षा करते समय, बहुलक-आधारित ग्रहण में मूल वीर्य के नमूने में शुक्राणुजोज़ा की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए CASA प्रणाली का उपयोग करके वीर्य के नमूने का विश्लेषण करें।
    1. CASA प्रणालीको पावर स्विच खोल्नुहोस् र अनुप्रयोगको सफ्टवेयर खोल्न SCA SCOPE आइकन डबल-क्लिक गर्नुहोस्।
    2. नमूना लेने से पहले, बार-बार pipetting द्वारा झटका और अच्छी तरह से एक बहुलक आधारित विंदुक के साथ फिर से मूल वीर्य नमूना homogenize.
    3. 10 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और नॉब को घुमाकर स्केल को 10 माइक्रोन तक समायोजित करें। विंदुक टिप बदलें, मूल वीर्य नमूने के 10 माइक्रोन अप विंदुक, और एससीए गिनती कक्ष में जगह है. वीर्य के नमूने के बहने को रोकने के लिए 60 एस तक प्रतीक्षा करें।
    4. CASA प्रणाली के नमूना धारक पर SCA गिनती कक्ष की स्थिति और औपचारिक परीक्षा के लिए तैयार करने के लिए आवेदन सॉफ्टवेयर के संवाद बॉक्स में रोगी की जानकारी सेट.
    5. स्टार्ट बटन पर क्लिक करके CASA सिस्टम के साथ SCA गिनती कक्ष में मूल वीर्य के नमूने की जांच करें और आवश्यक डेटा रिकॉर्ड करें, जैसे कि शुक्राणुजोज़ा की एकाग्रता।

4. पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स और शुक्राणुजोज़ा का अवलोकन

  1. 1000 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और घुंडी को घुमाकर पैमाने को 1000 माइक्रोन तक समायोजित करें। पिपेट टिप को बदलें, फिर बार-बार पिपेट द्वारा उड़ाएं और अभिकारक को अच्छी तरह से समरूप करें, जिसमें वीर्य का नमूना और अपकेंद्रित्र ट्यूब में काम करने वाला समाधान फिर से 30 मिनट की प्रतिक्रिया प्रक्रिया के अंत में होता है।
  2. 10 माइक्रोन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें और नॉब को घुमाकर स्केल को 10 माइक्रोन तक समायोजित करें। पिपेट टिप को बदलें, ऊपर वर्णित अभिकारक के 10 माइक्रोन तक पिपेट, और इसे शुक्राणु गिनती कक्ष में रखें। अंत में, एक समर्पित ग्लास कवरस्लिप के साथ शुक्राणु गिनती कक्ष को कवर करें।
  3. सूक्ष्म चरण पर शुक्राणु गिनती कक्ष प्लेस और दो 10x eyepieces के साथ ऑप्टिकल खुर्दबीन के बिजली स्विच पर बारी. फिर, अभिकारक नमूने के बहाव को रोकने के लिए 60 s की प्रतीक्षा करें।
  4. प्रतीक्षा समय के दौरान माइक्रोस्कोपिक कनवर्टर को 10x ऑब्जेक्टिव लेंस पर स्विच करें। फिर मोटे समायोजन घुंडी और ठीक समायोजन घुंडी को क्रम में समायोजित करें। अंत में, 10×10 के आवर्धन के तहत शुक्राणुजोज़ा और गोल कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
  5. विश्लेषण किए जाने वाले दृश्य के क्षेत्र का निर्धारण करने के बाद सूक्ष्म कनवर्टर को 40x उद्देश्य लेंस पर स्विच करें, और 10 × 40 के आवर्धन के तहत शुक्राणुजोज़ा और भूरे रंग के पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स का निरीक्षण करें।
  6. कम से कम 200 शुक्राणुजोज़ा और संबंधित क्षेत्रों के भीतर भूरे रंग के पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की संख्या की गणना करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक काउंटर सिस्टम का उपयोग करें।

5. पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की एकाग्रता की गणना

  1. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की एकाग्रता की गणना करें:
    Equation 1

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Representative Results

उपरोक्त प्रक्रिया को लागू करने पर, अपकेंद्रित्र ट्यूब में अभिकारक अक्सर एक सबट्रांसलूसेंट, ओपेलेसेंट उपस्थिति(चित्रा 1)प्रकट करता है। स्पष्ट रूप से भूरे रंग के रंग का पता लगाने से ल्यूकोसाइट्स के संभावित क्षरण का पता चलता है, जिसके परिणामस्वरूप तरल धुंधला हो सकता है। नतीजतन, धुंधला प्रक्रिया विफल हो सकता है, यह आवश्यक या तो फिर से दाग या21 retesting के लिए एक नया वीर्य नमूना एकत्र करने के लिए प्रतिपादन.

पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स ने एक भूरे रंग का रंग प्रदर्शित किया, जो बेदाग साधारण गोल कोशिकाओं (चित्रा 2, साधारण स्लाइड) के विपरीत था। इसके बाद, वर्तमान माइक्रोस्कोप क्षेत्र के तहत प्रत्येक शुक्राणुजून और भूरे रंग के ल्यूकोसाइट को निरंतर अवलोकन और मिलान के लिए पूरी तरह से नए क्षेत्र में स्थानांतरित करने से पहले गिना गया था। इष्टतम सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, कम से कम 200 शुक्राणुजोज़ा और देखने के संबंधित क्षेत्र में मौजूद ल्यूकोसाइट्स की गणना करना आवश्यक है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिक्रियाशील समाधान। प्रतिक्रिया प्रक्रिया को पूरा करने वाला अभिकारक एक सबट्रांसलूसेंट ओपेलेसेंट तरल है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (साधारण स्लाइड) के तहत अवलोकन। (ए) पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट और (बी) साधारण गोल सेल 10 x 40 आवर्धन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर मनाया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऑर्थो-टोल्यूइडाइन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड में प्रकाश संवेदनशील गुण होते हैं और प्रकाश के संपर्क में आने पर विघटित हो सकते हैं। परीक्षण अभिकर्मकों की प्रभावशीलता सुनिश्चित करने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि तैयार काम करने वाले तरल पदार्थ को एक अंधेरी जगह में संग्रहीत किया जाए।

वीर्य के नमूने स्वाभाविक रूप से विषम विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं। वीर्य के नमूनों की तैयारी की प्रक्रिया में, वीर्य के द्रवीकरण राज्य को सही ढंग से पहचानना और प्रत्येक नमूने से पहले वीर्य के नमूनों को अच्छी तरह से समरूप बनाना परीक्षण के परिणामों की विश्वसनीयता में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है। वीर्य के नमूने 15 मिनट के भीतर पूरी तरह से द्रवीभूत हो जाते हैं। यांत्रिक homogenizing या एंजाइमी पाचन पर विचार किया जाना चाहिए अगर वे पूरी तरह से 60 मिनट के बाद तरलीकृत नहीं है. अधिक सजातीय वीर्य के नमूने धीरे एक दो आयामी प्रकार के बरतन8 का उपयोग द्रवीकरण प्रक्रिया के दौरान लगातार नमूना कंटेनर मिलाते हुए द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

इस पत्र में प्रस्तुत परीक्षा पद्धति में सादगी, गति और लागत-प्रभावशीलता के फायदे हैं। हालांकि, यह कुछ परिस्थितियों में फायदेमंद नहीं हो सकता है: पेरोक्सीडेज को एज़ुरोफिलिक कणिकाओं में संग्रहीत किया जाता है जो सक्रियण21,22 पर क्षरण या साइटोपेम्पसिस के माध्यम से अंतरकोशिकीय अंतरिक्ष में स्रावित होगा। नतीजतन, न्यूट्रोफिल दागने में विफल हो सकते हैं और उनकी पहचान नहीं की जा सकती है। ऐसे मामलों में, धुंधला प्रक्रिया को दोहराना या यहां तक कि रोगी को फिर से परीक्षा के लिए एक नया वीर्य नमूना प्रदान करने की आवश्यकता होती है। इस स्थिति को कम करने के लिए, यह न्यूनतम प्लेसमेंट समय और एक कोमल homogenizing प्रक्रिया के साथ जब भी संभव ताजा वीर्य के नमूने का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. यह विधि केवल सक्रिय बीमारियों या संक्रमण की पहचान कर सकते हैं और बाद के चरणों में रोगों की पहचान नहीं कर सकते, जैसे कि पुराने संक्रमण16. इसके अतिरिक्त, कम पेरोक्सीडेज सामग्री के साथ अन्य प्रकार के ल्यूकोसाइट्स, जैसे लिम्फोसाइट्स, मैक्रोफेज और मोनोसाइट्स, इस पद्धति का उपयोग करके धुंधला होने में कठिनाइयों का सामना करते हैं; इसलिए, ल्यूकोसाइट एंटीजन (जैसे, सीडी 45) इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला को नियोजित करके विश्वसनीय परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।

जैसा कि डब्ल्यूएचओ मैनुअल के 5 वें संस्करण द्वारा आवश्यक है, पारंपरिक सकारात्मक मायलोपेरोक्सीडेज धुंधला (एंडट्ज़ परीक्षण) को उनकी एकाग्रताकी गणना करने के लिए रक्त कोशिका गिनती प्लेट में कम से कम 200 पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की सूक्ष्म गिनती की आवश्यकता होती है। पारंपरिक मैनुअल Endtz परीक्षण की तुलना में, यह प्रोटोकॉल CASA डिटेक्शन द्वारा प्राप्त शुक्राणुजोज़ा एकाग्रता डेटा का परिचय देता है, मैनुअल और स्वचालित तरीकों का संयोजन करता है। पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की एकाग्रता की गणना करने के लिए, कम से कम 200 शुक्राणुजोज़ा और ल्यूकोसाइट्स को माइक्रोस्कोप के तहत गिना जाता था। चूंकि वीर्य में शुक्राणुजोज़ा की एकाग्रता ल्यूकोसाइट्स की तुलना में बहुत अधिक है, इसलिए 200 पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की गिनती की तुलना में 200 शुक्राणुजोज़ा की गिनती के लिए कम समय की आवश्यकता थी।

गंभीर ओलिगोस्पर्मिया, क्रिप्टोज़ोस्पर्मिया और एज़ोस्पर्मिया वाले मरीजों को अक्सर पर्याप्त संख्या में शुक्राणुजोज़ा की गिनती में चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। ऐसे मामलों में, पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की एकाग्रता को सीधे रक्त कोशिका गिनती प्लेट का उपयोग करके गणना की जा सकती है जैसा कि प्लेट के लिए मैनुअल में वर्णित है। इसके अतिरिक्त, उन रोगियों के लिए जिन्हें CASA उपकरण के बिना CASA या प्रयोगशालाओं की आवश्यकता नहीं होती है, पेरोक्सीडेज-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए रक्त कोशिका गिनती प्लेट का भी उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन के लिए सुविधाएं प्रदान करने के लिए सेंटर फॉर रिप्रोडक्टिव मेडिसिन के एंड्रोलॉजी लेबोरेटरी, सन यात-सेन विश्वविद्यालय के तीसरे संबद्ध अस्पताल के आभारी हैं। इस लेख की तैयारी में कोई धन शामिल नहीं था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD 20230301 Agentia B
6% (v/v) hydrogen peroxide solution ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD 20230301 Agentia D
Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE  Microptic S.L. 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment
Disposable centrifugal tube (1.5 mL) Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD 2210009 Centrifugal tube for Staining process
Disposable transfer pipette (3 mL) Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD 20221101 Polymer-based pipette
Electronic counter None None A multichannel counter
Electronic scales Shanghai Liangping Instrument Co., LTD D9008084 MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g
Makler counting chamber Makler MQ30004 0.01 sq.mm, 10 μm deep
Optical microscope Olympus 3G41067201307 CX31, 10×40
Ortho-toluidine substrate solution ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD 20230301 Agentia C
Pipet tips(1 mL) Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd 02923205 1000 tips/unit, 5 units/case
Pipet tips(10 µL) Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd 00323961 1000 tips/unit, 20 units/case
Pipet tips(200 µL) Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd 32822810 1000 tips/unit, 20 units/case
Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD 20230301 Agentia A
SCA counting chamber Microptic S.L. 102230608 10 µm, 2 Chambers
The container for semen sample Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD 20230701 Polymer-based receptacle for semen sample
Thermostatic table Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD MQ30004 MQ-300
Transfer pipette (10 µL) Eppendoff 3121000.015
Transfer pipette (1000 µL) Eppendoff 3121000.12
Transfer pipette (200 µL) Eppendoff 3121000.082
Two-dimensional shaker DragonLab 822000010000 VC5A002205

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References

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Li, X., Cai, X., Cai, L., Ou, J. The … More

Li, X., Cai, X., Cai, L., Ou, J. The Examination of Peroxidase-Positive Leukocytes in Semen. J. Vis. Exp. (203), e66211, doi:10.3791/66211 (2024).

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