Screening for genomiske modifikationer: En metode til at identificere CRISPR-genererede mutanter i Drosophila

Abstract

Kilde: Du, L., et al. En effektiv strategi for generering af vævsspecifikke binære transskriptionssystemer i Drosophila ved genomredigering. J. Vis. Exp. (2018).

Denne video beskriver en screening metode til at identificere transgene Drosophila fluer, hvis genom blev ændret ved hjælp af CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 er et kraftfuldt genomredigeringsværktøj, der revolutionerede den måde, hvorpå forskere kan manipulere en organismes genom. I eksempelprotokollen vil vi se, hvordan vi identificerer CRISPR-genererede mutanter, hvor en indsættelse af en transaktiveringssekvens erstatter den første exon af det branchless (bnl) gen, hvilket skaber en bnl genspecifik driverlinje, bnl-LexA.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Du et al.,En effektiv strategi for generering af vævsspecifikke binære transskriptionssystemer i Drosophila ved genomredigering, J. Vis. Exp. (2018). 1. Flyvegenetik og screening (figur 1 og figur 2) Når de injicerede embryoner udvikler sig til voksne, krydser hver enkelt G0 fluer til balancer fluer. Vælg passende balancer til kromosomet, der indeholder den målrettede allel. Bedøve F1 afkom fra hver…

Representative Results

Figur 1: En oversigt over arbejdsgangen for CRISPR/Cas9-medieret genomredigering for at generere et binært transskriberingssystem. Den omtrentlige varighed, der kræves for hvert trin, er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_up…

Materials

Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation