Dépistage des modifications génomiques : une méthode pour identifier les mutants générés par CRISPR à Drosophila

Overview

Cette vidéo décrit une méthode de dépistage pour identifier les mouches transgéniques de Drosophila, dont le génome a été modifié à l’aide de CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 est un puissant outil d’édition du génome qui a révolutionné la façon dont les scientifiques peuvent manipuler le génome d’un organisme. Dans le protocole de l’exemple, nous verrons comment identifier les mutants générés par CRISPR, dans lesquels une insertion d’une séquence de transactivation remplace le premier exon du gène sans branche (bnl),créant ainsi une ligne pilote spécifique au gène bnl, bnl-LexA.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Du et coll.,An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila par Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Génétique et dépistage des mouches (figure 1 et figure 2)

1. Lorsque les embryons injectés se développent en adultes, traverser chaque G_{0 mouches à} des mouches équilibreurs. Sélectionnez l' équilibreur approprié pour le chromosome contenant l’allèle ciblé.
2. Anesthésier la progéniture F1 de chaque croix G0 sur un tampon de CO₂ et choisir au hasard 10-20 mâles sous un stéréomicroscope. Croisez-les individuellement aux femelles équilibreurs comme le montre la figure 2.
3. Lorsque les larves de F2 éclosent, choisissez le père F1 unique de chaque croix et extrayez l’ADN gDNA à l’aide du protocole de préparation de l’ADN génomique à mouche unique :
   1. Préparer le tampon d’extraction gDNA : 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, conserver à température ambiante. Préparer la solution de stock Proteinase K de 20 mg/mL et la conserver au congélateur.
   2. Mettez chaque mouche dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 mL et étiquetez le tube. Conserver au congélateur à -80 °C pendant la nuit.
   3. Préparer un nouveau volume de travail de tampon d’extraction gDNA contenant 200 μg/mL de concentration finale de Proteinase K.
      Remarque : N’utilisez pas un ancien tampon pour cette étape.
   4. Squish chaque mouche pendant 10-15 s avec une pointe pipette contenant 50 μL de tampon squishing sans distribuer le liquide. Distribuez le tampon restant dans le tube et mélangez bien. Incuber à 37 °C pendant 20 à 30 min.
   5. Mettre les tubes dans un bloc thermique de 95 °C pendant 1 à 2 min pour inactiver la Proteinase K.
   6. Tournez vers le bas pendant 5 min à 10.000 x g. Conservez la préparation à 4 °C pour une analyse PCR plus poussée.
4. Utilisez la même méthode pour préparer l’ANDN à partir d’une mouche nos-Cas9, qui sert de contrôle négatif. Effectuez des écrans PCR en trois étapes pour identifier le correct HDR « ends out » (Figure 1, Figure 3) en utilisant l’AND de chaque mâle F1 comme^{modèle 5}. Utilisez 1 μL de la préparation de l’ADN dans le système de réaction PCR suivant : 10 μL de 2x PCR Master Mix with Dye, 1 μL de chaque amorce (10 μM), 1 μL de modèle d’ADN et 7 μL de ddH₂O.
5. Comme le montre la figure 3A ,effectuezpcr en utilisant des amorces fwd1 et rev1 pour dépister l’existence de l’insertion ou le remplacement; effectuer pcr en utilisant fwd2 et rev2 amorce pour vérifier l’insertion ou le remplacement de la région de 3'; effectuer PCR à l’aide d’amorces M13F et rev3 pour vérifier « ends-in » HDR (Tableau 1C).
6. Gardez les lignes de vol avec le HDR de fin confirmée et établissez des stocks équilibrés de la génération F2. Outcross à l' équilibreur vole à nouveau pour enlever toutes les mutations involontaires sur d’autres chromosomes.

Representative Results

Figure 1 : Aperçu du flux de travail pour l’édition du génome à base de CRISPR/Cas9 pour générer un système de transcription binaire. La durée approximative requise pour chaque étape est indiquée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Illustration du programme de dépistage CRISPR et de croisement génétique pour l’établissement de lignes de mouches éditées par le génome. Dans les croisements génétiques, R signifie l’allèle édité qui est sur le chromosome^3ème. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), est un marqueur chromosomique 3ème ; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) est un^3ème chromosomique. Les stocks de mouches édités par génome sont vérifiés par PCR amplifiant les régions cibles d’intérêt de l’ADN génomique extrait des mouches de la génération F2 ou F3 et la séquence déterminant les produits PCR. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Génération de bnl-LexA par remplacement d’exon à base de CRISPR/Cas9. (A) Dessin schématique représentant la stratégie du HDR à base de CRISPR/Cas9 pour le remplacement des exons dans le locus bnl. Boîte - exon; ligne-intron; donneur de remplacement (pDonor-bnl:LexA)et deux résultats possibles du HDR ont été montrés. Le pDonor-bnl:LexA avait les caractéristiques suivantes: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) séquence flanquée de 2 kb et 1,8 kb de long bras d’homologie (lignes pointillées), (2) un peptide auto-cleaving T2A entre l’exon bnl terminal N résiduel et la séquence nls-LexA:p65, et (3) un codon d’arrêt de traduction (rouge *) après la séquence nls-LexA:p65. Le produit HDR a conservé tout le contrôle transcriptionnel et post-transcriptionnel du bnl,et la protéine LexA:p65 devrait être produite dans le même modèle que la bnl endogène. Les petites flèches noires montrent les sites de liaison relatifs (et non à l’échelle) des amorces PCR (tableau 1) utilisés pour le criblage en trois étapes ou la validation RT-PCR. (B) Photos de gel Agarose montrant les résultats du dépistage pcr en trois étapes. Les produits PCR amplifiés à partir de l’ADN génomique de quatre lignes HDR à extrémité réussie sont montrés; contrôle négatif, l’ADN génomique de nos-Cas9 lignée parentale; contrôle positif, pDonor-bnl:LexA plasmide; M, Marqueur (échelle d’ADN SL2K). (C) Un exemple du gel de criblage montrant le produit PCR attendu à l’aide des amorces M13F et rev3 pour les lignes de fin d’année; M8-7 et M9-6 sont deux lignes de bout en bout; contrôles négatifs et positifs, les mêmes qu’en B; M, Marqueur (échelle d’ADN de l’ONÉ de 1 kb). (D) Analyse RT-PCR sur l’ARN total de bnl-LexA et les mouches de contrôle nos-Cas9. L’amorce avant se lie à une région spécifique de LexA, l’amorce inverse se lie à une région d’exon bnl en aval ; ~440 bp (paire de base) bande d’amplification (*) a été détecté à partir de RT-PCR sur bnl-LexAARNm, mais pas de l’ARN de contrôle. M, marqueur de 100 pb (ONÉ). Adapté des figures 2 et S1 dans Du et al. 2017. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.

A. clonage et séquençage de l’ARN
bnl-lexA gRNA fwd	TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTGTATCTGCGAT TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTGTATCTGCGAT TATATAGGAAAGAT
	GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA rev	ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAACTCCCGCAATATCTGAAGG ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCCCGCAATATCTGAAGG ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTTATAAAACTCCCGCAATATCTGAAGG ATTTTA
	ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
Amorce T3 utilisée pour le séquençage	CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3'
REMARQUE : les nucléotides ont souligné anneal au promoteur de U6 ou noyau de gRNA sur le vecteur de pCFD4, le g/c inférieur a été ajouté pour aider la transcription promoteur-dépendante de U6
B. Construction de donateurs HDR
bnl N-F_pUC19	AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggctggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccgtctcgccgga GCCCGCAGATACAAGGCCCC
lexA-F	CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC
lexA-R (lexA-R)	CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC
bnl lexA-C Fwd Bnl lexA-C Fwd bnl lexA-C Fwd bnl	TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC TAAAAACTCGTTTAGACGGGGGGCGTTGTCAAC TAAAAACTCGTTTAGACGGGGGGCGTTGTCAAC TAA
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg
REMARQUE : Les nucléotides dans le chevauchement de capital avec le vecteur de pUC19 pour l’assemblage de Gibson, les nucléotides soulignés étaient le surplomb de séquence pour l’addition de peptide de T2A.
C. Dépistage et séquençage hdr
bnl-lexA scr fwd1 bnl-lexA scr fwd1 bnl-lexA scr fwd1 bnl	GTGGCGCACGCCCAATAAAC GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-lexA scr rev1	GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexA scr fwd2 bnl-lexA scr fwd2 bnl-lexA scr fwd2 bnl	CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC (en)
ends-in check rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexA seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
REMARQUE: Ces amorces ont été utilisées pour le criblage et le séquençage du PCR, les emplacements approximatifs des sites de liaison d’amorce sont indiqués dans la figure 5A sous le nom de fwd1-2 et rev1-3.
Analyse D. RT-PCR
RT-f (RT-f)	GATATGGATTTCCGCTTTGCTG GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG GATATGG
RT-r (RT-r)	CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG

Tableau 1 : Amorce utilisée dans cette étude. ( A )Amorcepour clonage gRNA vecteur d’expression et de séquençage. (B) Amorce pour le clonage hdr modèle de donneur. (C) Amorce pour le dépistage et le séquençage des produits HDR. (D) Amorce utilisée pour la vérification RT-PCR du produit chimérique lexA-bnl d’ARNm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation