Overview
यह वीडियो ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला मक्खियों की पहचान करने के लिए एक स्क्रीनिंग विधि का वर्णन करता है, जिसका जीनोम CRISPR-Cas9 का उपयोग करके संशोधित किया गया था । CRISPR-Cas9 एक शक्तिशाली जीनोम संपादन उपकरण है कि जिस तरह से वैज्ञानिकों को एक जीव के जीनोम हेरफेर कर सकते है क्रांतिकारी बदलाव है । उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम देखेंगे कि CRISPR-जनित म्यूटेंट की पहचान कैसे की जाए, जिसमें एक ट्रांसएक्टिवेशन अनुक्रम का सम्मिलन शाखारहित (बीएनएल)जीन के पहले एक्सोन की जगह जाता है, इस प्रकार बीएनएल जीन-विशिष्ट ड्राइवर लाइन, बीएनएल-लेक्साका निर्माण होता है।
Protocol
यह प्रोटोकॉल डु एट अलसे एक अंश है, जो जीनोम संपादन, जे विस एक्सपी (2018) द्वारा ड्रोसोफिला में ऊतक-विशिष्ट बाइनरी ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम उत्पन्न करने के लिए एक कुशल रणनीति है।
1. फ्लाई जेनेटिक्स और स्क्रीनिंग (चित्रा 1 और चित्रा 2)
- जब इंजेक्शन भ्रूण वयस्कों में विकसित होते हैं, तो प्रत्येक एक जी0 मक्खियों को बैलेंसर मक्खियों को पार करें। लक्षित एलील युक्त गुणसूत्र के लिए उपयुक्त बैलेंसर का चयन करें।
- एक सीओ 2 पैड पर प्रत्येक G0 क्रॉस से F1 संतानों को एनेस्थेटाइज करें और बेतरतीबढंग से स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत 10-20 पुरुषों को चुनें। चित्र 2में दर्शाए गए बैलेंसर महिलाओं के लिए उन्हें व्यक्तिगत रूप से पार करें ।
- जब F2 लार्वा हैच, प्रत्येक क्रॉस से एकल F1 पिता उठाओ और एकल मक्खी जीनोमिक डीएनए तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग कर gDNA निकालने:
- तैयार जीडीएनए निष्कर्षण बफर: 10 एमएम ट्रिस-सीएल पीएच 8.2, 1 एमएम ईडीटीए, 25 एमएम एनएसीएल, कमरे के तापमान पर स्टोर करें। 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज के स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और फ्रीजर में स्टोर करें ।
- प्रत्येक फ्लाई को 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें और ट्यूब को लेबल करें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर रखें।
- प्रोटीनेज के 200 माइक्रोग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता वाले जीडीएनए निष्कर्षण बफर की एक ताजा कार्य मात्रा तैयार करें।
नोट: इस चरण के लिए पुराने बफर का उपयोग न करें। - प्रत्येक फ्लाई को 10-15 एस के लिए एक पिपेट टिप के साथ स्क्वीश करें जिसमें तरल को वितरित किए बिना 50 माइक्रोशिंग बफर होता है। बचे हुए बफर को ट्यूब में बांटें और अच्छी तरह मिलाएं। 20-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- प्रोटीनेज के को निष्क्रिय करने के लिए 1-2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में ट्यूब डालें।
- 10,000 x ग्राम पर 5 मिनट केलिए नीचे स्पिन। आगे पीसीआर विश्लेषण के लिए तैयारी को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एक नग-Cas9 फ्लाई से gDNA तैयार करने के लिए एक ही विधि का उपयोग करें, जो एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। एक टेम्पलेट5के रूप में प्रत्येक F1 पुरुष के gDNA का उपयोग कर सही "समाप्त होता है" HDR(चित्रा 1, चित्रा 3)की पहचान करने के लिए तीन कदम पीसीआर आधारित स्क्रीन प्रदर्शन करते हैं । निम्नलिखित पीसीआर रिएक्शन सिस्टम में डीएनए प्रेप के 1 माइक्रोन का उपयोग करें: डाई के साथ 2x पीसीआर मास्टर मिक्स के 10 माइक्रोन, प्रत्येक प्राइमर (10 माइक्रोन) के 1 माइक्रोन, डीएनए टेम्पलेट के 1 माइक्रोन, और डीडीएच 2 ओ के7माइक्रोन का उपयोग करें।
- जैसा कि चित्र 3एमें दिखाया गया है, प्रविष्टि या प्रतिस्थापन के अस्तित्व के लिए स्क्रीन करने के लिए प्राइमर fwd1 और rev1 का उपयोग करके पीसीआर प्रदर्शन करें; 3'क्षेत्र से प्रविष्टि या प्रतिस्थापन को सत्यापित करने के लिए fwd2 और rev2 प्राइमर का उपयोग करके पीसीआर करें; "एंड्स-इन" एचडीआर(टेबल 1C)की जांच करने के लिए प्राइमर M13F और rev3 का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
- पुष्टि की समाप्त होता है बाहर HDR के साथ मक्खी लाइनों रखें और F2 पीढ़ी से संतुलित स्टॉक स्थापित करें । बैलेंसर के लिए आउटक्रॉस अन्य गुणसूत्रों पर किसी भी अनपेक्षित उत्परिवर्तन को हटाने के लिए फिर से उड़ता है।
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Representative Results
चित्रा 1: एक बाइनरी ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम उत्पन्न करने के लिए CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए कार्यप्रवाह का अवलोकन। प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक अनुमानित समय अवधि इंगित की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: जीनोम-संपादित फ्लाई लाइनों की स्थापना के लिए CRISPR स्क्रीनिंग और आनुवंशिक क्रॉस योजना का एक उदाहरण । जेनेटिक क्रॉस में, आर संपादित एलील के लिए खड़ा है जो 3गुणसूत्र पर है। एमकेआरएस (टीपी (3;3) एमआरएस, एम (3)76ए [1] कार [1] आरवाई [2] एसबी [1],एक 3गुणसूत्र मार्कर है; TM6B (in (3LR) TM6B, Antp [हू] ई [1] टीबी [1]) एक 3गुणसूत्र बैलेंसर है । जीनोम संपादित फ्लाई स्टॉक पीसीआर द्वारा सत्यापित किए जाते हैं, जो एफ 2 या एफ 3 पीढ़ी मक्खियों और पीसीआर उत्पादों का निर्धारण करने वाले अनुक्रम से निकाले गए जीनोमिक डीएनए से ब्याज के लक्षित क्षेत्रों को बढ़ाना है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: CRISPR/Cas9-मध्यस्थता एक्सन रिप्लेसमेंट द्वारा बीएनएल-लेक्सा की पीढ़ी । (क) बीएनएल लोकस में प्रतिस्थापन के लिए CRISPR/Cas9 मध्यस्थता एचडीआर की रणनीति को दर्शाती योजनाबद्ध ड्राइंग । बॉक्स - exon; लाइन- इंट्रोन; प्रतिस्थापन दाता (pDonor-bnl:लेक्सए)और एचडीआर के दो संभावित परिणाम दिखाए गए। PDonor-bnl: लेक्सा निम्नलिखित विशेषताएं थीं: (1) T2A-nls-LexA: p65 (~ 1.8kb) अनुक्रम 2 kb और 1.8 kb लंबी होमोलॉजी हथियारों (धराशायी लाइनों) द्वारा flanked (2) अवशिष्ट एन टर्मिनल बीएनएल एक्सोन और एनएलएस-लेक्सा एक्सोन केबीच एक T2A सेल्फ-क्लीविंग पेप्टाइड: पी65, और (3) एनएलएस-लेक्सा:पी65 अनुक्रम के बाद एक अनुवाद स्टॉप कोडन (लाल *) । एचडीआर उत्पाद ने बीएनएलके सभी ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण को बनाए रखा, और लेक्सा: पी65 प्रोटीन को अंतर्जात बीएनएल के समान पैटर्न में उत्पादित किए जाने की उम्मीद है। छोटे काले तीर पीसीआर प्राइमर(तालिका 1)के सापेक्ष बाध्यकारी साइटों (पैमाने में नहीं) को दिखाते हैं जो 3-चरण स्क्रीनिंग या आरटी-पीसीआर सत्यापन के लिए उपयोग किए जाते हैं। (ख) एगर उठे जेल चित्र 3-स्टेप पीसीआर स्क्रीनिंग के परिणाम दिखाते हैं । चार सफल एंड्स-आउट एचडीआर लाइनों के जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित पीसीआर उत्पादों को दिखाया गया है; नकारात्मक नियंत्रण, नगके जीनोमिक डीएनए-Cas9 माता पिता की रेखा; सकारात्मक नियंत्रण,pDonor-bnl: लेक्सा प्लाज्मिड; एम, मार्कर (SL2K डीएनए सीढ़ी) । (ग) स्क्रीनिंग जेल का एक उदाहरण जिसमें प्राइमर M13F और रेव3 का उपयोग करके अपेक्षित पीसीआर उत्पाद को दिखाया गया है; M8-7 और M9-6 दो सिरों में लाइनें हैं; नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण, बी में के रूप में ही; एम, मार्कर (एनईबी 1 केबी डीएनए सीढ़ी)। (घ) बीएनएल-लेक्सा से कुल आरएनए पर आरटी-पीसीआर विश्लेषण और नग-Cas9 नियंत्रण मक्खियों । फॉरवर्ड प्राइमर एक लेक्सा विशिष्ट क्षेत्र से बांधता है, रिवर्स प्राइमर एक डाउनस्ट्रीम बीएनएल एक्सोन क्षेत्र से बांधता है; ~ 440 बीपी (बेस-पेयर) प्रवर्धन बैंड (*) बीएनएल-लेक्साएमआरएनए पर आरटी-पीसीआर से पता चला था, लेकिन कंट्रोल आरएनए से नहीं। एम, 100 बीपी मार्कर (एनईबी)। ड्यू एट अल में आंकड़े 2 और S1 से अनुकूलित । 2017. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| A. GRNA क्लोनिंग और अनुक्रमण | |
| बीएनएल-लेक्सा जीएनए एफडब्ल्यूडी | TATATAGAGATATCCGGGTGAACTTCGTTTTTTTTCTCTCGAT |
| जीसीसीसीसीसीटीसीटीटीजीएगागकैग | |
| बीएनएल-लेक्सा जीएनए रेव | ATTTTAACTTGCTATTTCTCTCTAAAACTCCCCCCAATCTGAAGG |
| ATCGACGATAATAATAATAAATAAATAGTC | |
| टी 3 प्राइमर अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया | CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3 ' |
| नोट: न्यूक्लियोटाइड्स ने PCFD4 वेक्टर पर U6 प्रमोटर या gRNA कोर को एनील को रेखांकित किया, U6 प्रमोटर-निर्भर प्रतिलेखन सहायता के लिए लोअरकेस जी/सी जोड़ा गया था | |
| B. एचडीआर दाता निर्माण | |
| बीएनएल एन-F_pUC19 | AATTCGAGCTCGGTACtttggtctgggctggaac |
| बीएनएल-लेक्सा-एन-आर | tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtctcccgga जीसीसीसीसीसीएगागासीसीसी |
| लेक्सा-एफ | CTactGacttgGGGaAtGTcTcGAgaagaCCCTGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC |
| लेक्सा-आर | CTAAACGAGTTTTTTAAGCAAACTCACTC |
| बीएनएल लेक्सा-सी एफडब्ल्यूडी | TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTTCAAC |
| बीएनएल सी-R_pUC19 | GCCAAGCTTGCATGCCtctccctgg |
| नोट: गिब्सन असेंबली के लिए pUC19 वेक्टर के साथ पूंजी ओवरलैप में न्यूक्लियोटाइड, न्यूक्लियोटाइड्स को रेखांकित किया गया था T2A पेप्टाइड अतिरिक्त के लिए अनुक्रम ओवरहांग । | |
| C. एचडीआर स्क्रीनिंग और अनुक्रमण | |
| बीएनएल-लेक्सा एससीआर fwd1 | जीटीजीजीसीसीएसीएएएसी |
| बीएनएल-लेक्सा एससीआर रेव1 | GATCCCAGCAATCTCCGTTG |
| बीएनएल-लेक्सा एससीआर एफडब्ल्यूडी2 | CAACGGAGATTGGCTGGGATC |
| बीएनएल-लेक्सा एससीआर रेव2 | CTGGCCAACTGTAGTAGAAGTC |
| समाप्त होता है जांच rev3 | GCAATGTTATTGCAATGCGTTGAC |
| बीएनएल-लेक्सा एसईक्यू एफडब्ल्यूडी3 | CACTTGTCGCCCATATTGATAATTATTG |
| नोट: इन प्राइमर का उपयोग पीसीआर स्क्रीनिंग और अनुक्रमण के लिए किया गया था, प्राइमर बाइंडिंग साइटों के अनुमानित स्थानों को चित्रा 5A में fwd1-2 और rev1-3 के रूप में दिखाया गया है। | |
| D. आरटी-पीसीआर विश्लेषण | |
| आरटी-एफ | GATATGGATTCTCCCCCCCCTTTG |
| आरटी-आर | CCATGCAGAGACAGCAAGTG |
तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर। (A)जीआरएनए एक्सप्रेशन वेक्टर और सीक्वेंसिंग की क्लोनिंग के लिए प्राइमर । (B)एचडीआर डोनर टेम्पलेट की क्लोनिंग के लिए प्राइमर । (ग)एचडीआर उत्पादों की स्क्रीनिंग और अनुक्रमण के लिए प्राइमर। }एम्रिक लेक्सा-बीएनएल एमआरएनए प्रोडक्ट के आरटी-पीसीआर वेरिफिकेशन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमर।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
