Screening för genomiska modifieringar: En metod för att identifiera CRISPR-genererade mutanter i Drosophila

Abstract

Källa: Du, L., et al. En effektiv strategi för att generera vävnadsspecifika binära transkriptionssystem i Drosophila genom genomredigering. J. Vis. Exp. (2018).

Denna video beskriver en screeningmetod för att identifiera transgena Drosophila flugor, vars genom ändrades med CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 är ett kraftfullt genomredigeringsverktyg som revolutionerade hur forskare kan manipulera en organisms genom. I exempelprotokollet kommer vi att se hur man identifierar CRISPR-genererade mutanter, där en insättning av en transaktiveringssekvens ersätter den första exon av den branchless (bnl)genen, vilket skapar en bnl genspecifik förarlinje, bnl-LexA.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Du et al., En effektiv strategi för att generera vävnadsspecifika binära transkriptionssystem i Drosophila av Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018). 1. Flyga genetik och screening (figur 1 och figur 2) När de injicerade embryona utvecklas till vuxna, korsa varje G0 flugor till balansflugor. Välj lämplig balanser för kromosomen som innehåller den riktade allelen. Söv F1-avkomman från varje G0-…

Representative Results

Bild 1: En översikt över arbetsflödet för CRISPR/Cas9-medierad genomredigering för att generera ett binärt transkriptionssystem. Den ungefärliga tidslängd som krävs för varje steg anges. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src…

Materials

Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation