Drosophila In Vivo Imaging calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

Overview

Questo video descrive l'imaging in vivo del calcio nei neuroni Drosophila usando GCaMP. La clip del protocollo in primo piano mostra come registrare i cambiamenti nella fluorescenza GCaMP dai neuroni del corpo dei funghi durante un esperimento di condizionamento olfattivo.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Imaging in vivo di calcio

1. Utilizzare un microscopio multifotono dotato di un laser a infrarossi e di un obiettivo di immersione in acqua (vedi Tabella dei materiali), installato su un tavolo isolato dalle vibrazioni. Per la visualizzazione di indicatori di calcio basati su GFP, sintonizzare il laser su una lunghezza d'onda di eccitazione di 920 nm e installare un filtro passa banda GFP.
2. Utilizzando la manopola di regolazione Z grossolana, scansionare attraverso l'asse Z del cervello e individuare la regione cerebrale di interesse. Utilizzare la funzione di ritaglio per mettere a fuoco la scansione solo su quest'area per ridurre al minimo il tempo di scansione e ruotare la vista di scansione in modo che la parte anteriore della testa sia rivolta verso il basso.
3. Regola la dimensione del fotogramma a 512 x 512 px, la velocità di scansione a > 4 Hz e la regione di scansione (nella dimensione Y) in modo che i neuroni di interesse siano coperti.

2. Visualizzazione dei transitori di calcio evocati dall'odore attraverso il condizionamento olfattivo

1. Utilizzare un sistema di erogazione degli odori in grado di fornire diversi stimoli di odore in modo temporaneamente preciso.
   1. Utilizzare un computer aggiuntivo per controllare il dispositivo e comunicare con il software del microscopio per immagini per coordinare le stimolazioni degli odori con l'acquisizione dell'immagine durante gli esperimenti.
   2. Avviare un pacchetto macro pre-programmato in grado di collegare il software di acquisizione delle immagini e il programma di distribuzione degli odori (ad esempio, un pacchetto macro VBA installato nel software di controllo del microscopio, vedere Table of Materials) che risponde a un trigger di input esterno fornito dall'avvio di un protocollo di consegna degli odori in un programma separato).
2. Inizia la misurazione monitorando i transitori di calcio evocati da odori "pre-allenamento"/ingenui con una risoluzione di 512 x 512 px e una frequenza fotogrammi di 4 Hz. Fornire uno stimolo odore di 2,5 s affiancato da un'acquisizione aggiuntiva dell'immagine per 6,25 s precedenti l'insorgenza dell'odore (per stabilire un valore di base F₀₎ e 12,5 s dopo l'offset dell'odore. Ripeti questo con un secondo odorante e poi con un terzo odorante.
3. Continuare 3 minuti dopo questa misurazione con il condizionamento classico ("allenamento") la mosca.
   1. Seleziona uno degli odori presentati nella fase di "pre-allenamento" per diventare l'odore CS⁺ e un altro per diventare il CS^- odore. Presentare l'odore CS⁺ utilizzando il sistema di odori controllato dal computer per 60 s insieme a dodici scosse elettriche da 90 V.
   2. Dopo una pausa di 60 s, presenta il CS^- odore da solo per 60 s. Utilizzare come odori 4-metilcicloesanolo e 3-ottanolo. Non presentare il terzo odore (ad esempio, 1-otten-3-olo) durante questo allenamento in quanto viene utilizzato come controllo solo prima (fase 2.2.) e dopo (fase 2.4) la fase di allenamento.
4. Misurare nuovamente i transitori di calcio evocati dagli odori "post-allenamento" ripetendo il protocollo di stimolazione degli odori "pre-allenamento" (fase 2.2.) 3 min dopo aver terminato la fase di allenamento (fase 2.3).
   NOTA: La tempistica di questo passaggio dovrebbe riflettere il tempo di interesse dopo la formazione della memoria (ad esempio, eseguire questo passaggio 3-4 minuti dopo la fase di condizionamento per indagare la memoria a breve termine). In genere, le mosche possono sopravvivere per diverse ore in questa preparazione.
5. Salva i file di imaging in un formato appropriato (ad esempio, Tiff) per un'analisi successiva delle immagini.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.