Drosophila In Vivo Kalciumavbildning: En metod för funktionell avbildning av neuronal aktivitet

Overview

Denna video beskriver in vivo kalcium imaging i Drosophila nervceller med GCaMP. Det presenterade protokollklippet visar hur man registrerar förändringar i GCaMP fluorescens från svampkroppsneuroner under ett luktkonditioneringsexperiment.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Inducerad Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Kalciumavbildning in vivo

1. Använd ett multifotonmikroskop utrustat med en infraröd laser och ett mål för vattensänkning (se Materialförteckning),installerat på ett vibrationsisolerat bord. För visualisering av GFP-baserade kalciumindikatorer, ställ in lasern på en excitationsvåglängd på 920 nm och installera ett GFP-bandpassfilter.
2. Med hjälp av den grove Z-justeringsknappen skannar du genom hjärnans Z-axel och lokaliserar hjärnans intresseområde. Använd beskärningsfunktionen för att fokusera skanningen på endast detta område för att minimera skanningstiden och för att rotera skanningsvyn så att huvudets främre är vänd nedåt.
3. Justera bildrutestorleken till 512 x 512 px, skanna hastighet till > 4 Hz och skanningsregion (i Y-dimensionen) så att nervcellerna av intresse täcks.

2. Visualisering av lukt-framkallade kalcium transienter genom luktkonditionering

1. Använd ett lukttillförselsystem som kan leverera flera luktstimuli på ett tidsmässigt exakt sätt.
   1. Använd ytterligare en dator för att styra enheten och för att kommunicera med bildmikroskopprogramvaran för att samordna luktstimuleringar med bildinspelning under experiment.
   2. Initiera ett förprogrammerat makropaket som kan länka bildförvärvsprogramvaran och luktleveransprogrammet (t.ex. ett VBA-makropaket installerat i mikroskopkontrollprogramvaran, se Materialförteckningen)som är responsivt för en extern inmatningsutlösare som tillhandahålls av initieringen av ett luktleveransprotokoll i ett separat program).
2. Starta mätningen genom att övervaka "förträning"/naiv lukt-framkallade kalciumtransienter med en upplösning på 512 x 512 px och en bildhastighet på 4 Hz. Leverera en 2,5 s luktstimulans flankerad av ytterligare bildförvärv för 6,25 s föregående luktstart (för att fastställa ett F₀ baslinjevärde) och 12,5 s efter luktförskjutning. Upprepa detta med en andra lukt och sedan med en tredje lukt.
3. Fortsätt 3 min efter denna mätning med klassisk konditionering ("träning") flugan.
   1. Välj en av de lukter som presenteras i "förträning" -fasen för att bli CS⁺ lukt och en annan för att bli CS^- lukt. Presentera CS^{+ lukt} med hjälp av det datorstyrda luktsystemet i 60-talet tillsammans med tolv 90 V elektriska stötar.
   2. Efter en paus på 60 s, presentera CS^- lukt ensam i 60-talet. Använd som luktämnen 4-metylcyklohexanol och 3-oktanol. Presentera inte den tredje lukten (t.ex. 1-okten-3-ol) under denna träning eftersom den endast används som kontroll före (steg 2.2.) och efter (steg 2.4) träningsfasen.
4. Mät "efterträning" lukt-framkallade kalcium transienter igen genom att upprepa "pre-training" lukt stimulering protokoll (steg 2.2.) 3 min efter avslutad utbildningsfas (steg 2.3).
   OBS: Tidpunkten för detta steg bör återspegla tiden för intresse efter minnesbildning (t.ex. utföra detta steg 3-4 min efter konditioneringssteget för att undersöka korttidsminnet). Vanligtvis kan flugor överleva i flera timmar i denna förberedelse.
5. Spara bildfiler i lämpligt format (t.ex. Tiff) för senare bildanalys.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.