Drosophila I Vivo Calcium Imaging: En metode til funktionel billeddannelse af neuronal aktivitet

Overview

Denne video beskriver in vivo calcium imaging i Drosophila neuroner ved hjælp af GCaMP. Den fremhævede protokol klip viser, hvordan du optager ændringer i GCaMP fluorescens fra champignon krop neuroner under en olfaktorisk conditioning eksperiment.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. In vivo calciumbilleddannelse

1. Brug et multifotonmikroskop udstyret med en infrarød laser og et mål for nedsænkning af vand (se Materialetabel), installeret på et vibrations isoleret bord. Til visualisering af GFP-baserede calciumindikatorer skal du indstille laseren til en excitationsbølgelængde på 920 nm og installere et GFP-båndpasfilter.
2. Brug den grove Z justering knop, scanne gennem Z-aksen i hjernen og finde hjernen region af interesse. Brug beskæringsfunktionen til kun at fokusere scanningen på dette område for at minimere scanningstiden og for at rotere scanningsvisningen, så hovedets forreste vender nedad.
3. Juster rammestørrelsen til 512 x 512 px, scan hastigheden til > 4 Hz, og scan region (i Y-dimensionen), så neuronerne af interesse er dækket.

2. Visualisering af lugt-fremkaldt calcium transienter gennem olfaktorisk konditionering

1. Brug en lugt levering system, der kan levere flere lugt stimuli i en tidsmæssigt præcis måde.
   1. Brug en ekstra computer til at styre enheden og til at kommunikere med billedmikroskopsoftwaren for at koordinere lugtstimuleringer med billedoptagelse under eksperimenter.
   2. Start en forprogrammeret makropakke, der er i stand til at forbinde billedanskaffelsessoftwaren og lugtleveringsprogrammet (f.eks. en VBA-makropakke, der er installeret i mikroskopkontrolsoftwaren, se Materialetabel), der reagerer på en ekstern inputudløser, der leveres af indledningen af en lugtleveringsprotokol i et separat program).
2. Start målingen ved at overvåge "pre-træning"/naiv lugt-fremkaldt calcium transienter ved en opløsning på 512 x 512 px og en billedhastighed på 4 Hz. Levere en 2,5 s lugt stimulus flankeret af yderligere billede erhvervelse for 6,25 s forudgående lugt debut (for at etablere en F₀ baseline værdi) og 12,5 s efter lugt offset. Gentag dette med en anden lugt og derefter med en tredje lugt.
3. Fortsæt 3 minutter efter denne måling med klassisk konditionering ("træning") fluen.
   1. Vælg en af de lugte præsenteret i "pre-træning" fase for at blive CS⁺ lugt og en anden til at blive CS^- lugt. Præsenter CS⁺ lugt ved hjælp af computerstyrede lugt-levere system til 60 s sammen tolv 90 V elektriske stød.
   2. Efter en 60 s pause, præsentere CS^- lugt alene i 60 s. Brug som lugtstoffer 4-methylcyclohexanol og 3-octanol. Præsenter ikke det tredje lugtstof (f.eks. 1-okten-3-ol) under denne træning, da det kun bruges som kontrol før (trin 2.2.) og efter (trin 2.4) træningsfasen.
4. Mål "post-uddannelse" lugt-fremkaldt calcium transienter igen ved at gentage "pre-uddannelse" lugt stimulation protokol (trin 2.2.) 3 min efter endt uddannelse fase (trin 2,3).
   BEMÆRK: Timingen af dette trin bør afspejle den tid af interesse efter hukommelse dannelse (f.eks udføre dette trin 3-4 min efter konditionering skridt til at undersøge korttidshukommelse). Typisk kan fluer overleve i flere timer i dette præparat.
5. Gem billedfiler i et passende format (f.eks. Tiff) til senere billedanalyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.