Drosophila In Vivo Imagem de cálcio: um método para imagem funcional da atividade neuronal

Overview

Este vídeo descreve imagens in vivo de cálcio em neurônios Drosophila usando GCaMP. O clipe de protocolo em destaque mostra como registrar alterações na fluorescência GCaMP de neurônios corporais de cogumelos durante um experimento de condicionamento olfativo.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity induced em Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Imagem de cálcio in vivo

1. Use um microscópio multifotográfico equipado com um laser infravermelho e um objetivo de imersão em água (ver Tabela de Materiais),instalado em uma mesa isolada de vibração. Para a visualização de indicadores de cálcio baseados em GFP, sintonize o laser em um comprimento de onda de excitação de 920 nm e instale um filtro de passagem de banda GFP.
2. Usando o botão de ajuste Z grosseiro, escaneie através do eixo Z do cérebro e localize a região cerebral de interesse. Use a função de cultura para focar a varredura apenas nesta área para minimizar o tempo de varredura e para girar a visão de varredura de modo que o anterior da cabeça esteja voltado para baixo.
3. Ajuste o tamanho do quadro para 512 x 512 px, velocidade de varredura para > 4 Hz e região de varredura (na dimensão Y) para que os neurônios de interesse sejam cobertos.

2. Visualização de transitórios de cálcio evocados por odor através de condicionamento olfativo

1. Use um sistema de entrega de odor que pode fornecer vários estímulos de odor de forma temporalmente precisa.
   1. Use um computador adicional para controlar o dispositivo e para se comunicar com o software de microscópio de imagem para coordenar estimulações de odor com captura de imagem durante experimentos.
   2. Inicie um pacote macro pré-programado capaz de vincular o software de aquisição de imagens e o programa de entrega de odor (por exemplo, um pacote macro VBA instalado no software de controle de microscópio, consulte Tabela de Materiais) que responde a um gatilho de entrada externo fornecido pelo início de um protocolo de entrega de odor em um programa separado).
2. Inicie a medição monitorando transitórios de cálcio evocados por "pré-treinamento" /ingênuos de odor em uma resolução de 512 x 512 px e uma taxa de quadros de 4 Hz. Fornecer um estímulo de odor de 2,5 s ladeado por aquisição de imagem adicional para o início do odor anterior de 6,25 (para estabelecer um valor de linha de base F₀₎ e 12,5 s de estímulo após odor. Repita isso com um segundo odor e depois com um terceiro odor.
3. Continue 3 minutos após esta medição com condicionamento clássico ("treinamento") da mosca.
   1. Selecione um dos odores apresentados na fase "pré-treinamento" para se tornar o odor CS⁺ e outro para se tornar o Odor CS^- odor. Apresente o odor CS⁺ usando o sistema de entrega de odor controlado por computador para 60 s ao lado de doze choques elétricos de 90 V.
   2. Depois de uma pausa de 60 s, apresente o CS^- odor sozinho para 60 s. Use como odores 4-metilciclonhexanol e 3-octanol. Não apresente o terceiro odor (por exemplo, 1-octen-3-ol) durante este treinamento, pois é usado como controle apenas antes (etapa 2.2.) e depois (etapa 2.4) da fase de treinamento.
4. Meça novamente os transitórios de cálcio evocados pelo odor "pós-treinamento", repetindo o protocolo de estimulação do odor "pré-treino" (etapa 2.2.) 3 minutos após o término da fase de treinamento (etapa 2.3).
   NOTA: O tempo desta etapa deve refletir o tempo de interesse após a formação da memória (por exemplo, realizar esta etapa 3-4 minutos após a etapa de condicionamento para investigar a memória de curto prazo). Normalmente, moscas podem sobreviver por várias horas nesta preparação.
5. Salve arquivos de imagem em um formato apropriado (por exemplo, Tiff) para análise posterior de imagens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.