Дрозофила Виво Кальциевая визуализация: метод функциональной визуализации нейронной активности

Overview

Это видео описывает в виво кальция изображений в дрогофила нейронов с помощью GCaMP. Рекомендуемые протокол клип показывает, как записывать изменения в GCaMP флуоресценции от нейронов грибного тела во время обонятельного кондиционирования эксперимента.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Хэнкок и др., In Vivo оптических кальция изображений обучения индуцированной синаптической пластичности в Drosophila меланогастер, J. Vis. Exp. (2019).

1. Виво кальция изображений

1. Используйте мультифотонный микроскоп, оснащенный инфракрасным лазером и целью погружения в воду (см. Таблицуматериалов), установленный на изолированном вибрацией столе. Для визуализации индикаторов кальция на основе GFP настройте лазер на восклицательный длина волны 920 нм и установите фильтр GFP band-pass.
2. Используя грубую ручку регулировки, сканируйте ось мозга и найдите область интереса мозга. Используйте функцию обрезки, чтобы сосредоточиться на сканировании только этой области, чтобы свести к минимуму время сканирования, и повернуть представление сканирования таким образом, чтобы передняя часть головы обращена вниз.
3. Отрегулируйте размер кадра до 512 x 512 px, сканируйте скорость до 4 Гц и сканируйте область (в измерении Y), чтобы покрыты нейроны, представляющие интерес.

2. Визуализация запах-вызванных кальция переходных через обонятельные кондиционирования

1. Используйте систему доставки запаха, которая может доставить несколько стимулов запаха в временно точной манере.
   1. Используйте дополнительный компьютер для управления устройством, а также для связи с программным обеспечением микроскопа для координации стимуляции запаха с захватом изображения во время экспериментов.
   2. Инициировать запрограммированный макропакет, способный связывать программное обеспечение для получения изображений и программу доставки запаха (например, макропакет VBA, установленный в программном обеспечении для управления микроскопом, см. Таблицуматериалов), который реагирует на внешний триггер ввода, предоставляемый запуском протокола доставки запаха в отдельной программе).
2. Начните измерение путем мониторинга "предварительной подготовки" / наивный запах вызванных кальция переходных при разрешении 512 х 512 px и частота кадров 4 Гц. Доставка 2,5 с запах стимулом в окружении дополнительного изображения приобретения для 6,25 с предыдущего запаха начала (установить F₀ базовое значение) и 12,5 с после запаха смещения. Повторите это со вторым одорантом, а затем с третьим одорантом.
3. Продолжить 3 мин после этого измерения с классическим кондиционирования ("обучение") летать.
   1. Выберите один из запахов, представленных в "предподготовки"^фазы, чтобы стать CS и запах, а другой, чтобы стать CS^- запах. Представляем cs и^{запах с} помощью управляемой компьютером системы доставки запаха для 60 с наряду с двенадцатью 90 V электрическим током.
   2. После 60 с перерыва, настоящее CS^{- запах} только для 60 с. Используйте в качестве одорантов 4-метилциклолексанол и 3-октанол. Не представлять третий одорант (например, 1-octen-3-ol) во время этого обучения, как он используется в качестве контроля только до (шаг 2.2.) и после (шаг 2.4) фазы обучения.
4. Измерьте «пост-тренировочный» запах кальция, снова преходяще, повторяя протокол стимуляции запаха «предварительной подготовки» (шаг 2.2.) через 3 мин после окончания тренировочной фазы (шаг 2.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки этого шага должны отражать время, интересное после формирования памяти (например, выполнить этот шаг 3-4 мин после кондиционирования шаг для исследования кратковременной памяти). Как правило, мухи могут выжить в течение нескольких часов в этой подготовке.
5. Сохранить файлы изображений в соответствующем формате (например, Tiff) для более длительного анализа изображений.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.