Nematodların Dondurulması-Çatlaması: Boyama için İç Solucan Dokularını Açığa Çıkarma Yöntemi

Overview

Bu videoda, C. elegans dokularını lütikülleri bozarak antikor boyama için erişilebilir hale getirmek için bir yöntem olan donma çatlaması açıklanmaktadır.

Protocol

Bu protokol,Tek Hücreli Düzeyde Hücreler Arası Lümen Morfogenez ve In Vivo Polarize Membran Biyogenez modeli olarak C. elegans Bağırsağı'ndan bir alıntıdır: Antikor Boyama ile Etiketleme, RNAi Fonksiyon Kaybı Analizi ve Görüntüleme, J. Vis. Exp. (2017).

C. elegans bağırsasının antikor lekesi

1. Fiksasyon
   1. Temiz bir cam slayt alın ve solucanların yapışacağı ince bir film oluşturmak için poli-L-lizin kullanın. Slayta 30 μL 0.1-0.2% poli-L lizin yerleştirin ve bir "sandviç" yapmak için poli-L-lizin damlasına ikinci bir slayt yerleştirin. Daha sonra her ikisinin de tüm yüzeylerini ıslatmak için slaytları birkaç kez hafifçe ovalayın ve 30 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Slaytların buzlu tarafını kalemle etiketleyin.
      NOT: 200 μL'lik %0,2 poli-L-lizin aliquots, tozun dH₂O'da çözünmesiyle yapılmıştır; bu -20 °C'de saklanabilir. Solucanların daha iyi yapışması için yüksek moleküler ağırlıklı poli-L-lizin kullanın. Poli-L-lizin konsantrasyonu da kritiktir. Çok düşük konsantrasyonlar solucanların yapışmasına izin vermez, ancak çok yüksek konsantrasyonlar floresan arka plan sinyali oluşturabilir. Çok kalın bir film bütünüyle gevşeyebilir.
   2. Sıvı nitrojenle dolu bir kabın(örneğin bir polistiren kabın) dibine sıkıca düz bir metal blok yerleştirin.
      NOT: Bunun yerine kuru buz kullanılabilir, ancak sıvı nitrojen konteyner tabanında metal bir bloğu daha sabit tutar ve iyi ürperir.
   3. Solucanları M9 ile tabaklarından yıkayarak toplayın veya her slayta farklı aşama solucanları (yumurta, L1, L2, L3 veya L4 larva evre solucanları) seçin. Tipik olarak, her slayta ~100 larva ve embriyo veya ~20 yetişkin seçin. Solucanlardan yıkanmış 10 μL'yi kaydırağın ortasına yerleştirin veya yumurta /solucanları 10 μL M9 veya 10 μL 1x PBS (fosfat tamponlu salin) içine alın.
      1. Topaklamayı önlemek için çok sayıda solucan yaymak için bir pipet kullanın.
         Not: Kalabalık ve farklı aşama kalınlığı nedeniyle yıkanmış solucanların karışık popülasyonları iyi yapışmaz ve daha az etkili bir şekilde dondurarak çatlar (aşağıya bakın), bu nedenle aşamaya özgü solucanların (veya senkronize popülasyonların) toplanması üstün sonuçlar verir. Larvalar yetişkinlerden daha iyi yapışır ve slayt başına daha fazla hayvan yerlenebilir.
      2. Solucanları slaytlara toplamadan önce, OP50 bakterisi olmayan bir Nematod Growth Medium (NGM) plakasına aktarın. Solucanlara yapışan aşırı bakteriler de yapışmaya engel olabilir. Solucanların kurumamaya dikkat edin.
   4. Toplanan solucanların üzerine, kenarları slaydın en az bir tarafına sarkacak şekilde 22 mm × 22 mm'lik bir kapak çapraz yollarını hafifçe yerleştirin (bırakın). Kapak kapağında bir veya iki parmağınızla hafifçe aşağı doğru bastırın. Doku bütünlüğüne zarar verecek makaslamadan kaçının.
   5. Slaytı hemen ve yavaşça sıvı nitrojendeki metal bloğa aktarın ve donması için yaklaşık 5 dakika bekletin. Daha sonra sarkan kenarı kullanarak kapakları tek bir hızlı hareketle "kaydırın".
      NOT: Bu adım kararlı bir şekilde yapılmalıdır ve üyük "çatlama" elde etmek için slayt dondurulurken. Dikkat: Sıvı nitrojenle çalışırken lütfen KKD (Kişisel Koruma Ekipmanı) yönergelerine uyun.
   6. Dondurarak çatlamış slaytları -20 °C'de 5 dakika boyunca metanoldolu bir cam Coplin kavanozuna batırın. Daha sonra -20 °C'de 5 dakika daha asetondolu bir cam Coplin kavanozuna aktarın.
      NOT: Metanol ve aseton kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca -20 °C'de saklanmalıdır. Sabitlemeden sonra, slaytlar -20 ° C'de saklanabilir.
      DİkKAT: metanol ve aseton toksiktir.
   7. Slaytları kavanozdan çıkarın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında (RT) kurumasına izin verin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC