Overview
果蝇 幼虫对光敏感,对周围光线的变化有反应。此视频描述了测试其避免光线的能力的检测,称为光点检测。特色协议演示了如何用蓝光 LED 设置检测,并演示了如何记录动物的行为以响应光线相遇。
Protocol
此协议文本摘自 Sun等人,基于光点的分析德罗索菲拉·拉瓦尔光塔西斯,J. Vis. Exp. (2019)。
1. 成像系统的设置
- 用铁夹夹紧一个高分辨率网络摄像机,在台式机的光点上方约10厘米处(图1)。
- 将相机镜头的方向调整到桌面。通过 USB 接口将摄像机连接到计算机。
- 在相机正下方的桌面上放置一个阿加板。
- 打开带有 Windows 7 的计算机上的"Amcap9.22"软件,光点将自动显示在 AMcap 的窗口中。稍微向左或向右移动相机,以确保光线点靠近窗口中心。确保摄像机不会阻挡光路径。光点应该是完整和圆的。
注: 该软件可以在 http://amcap.en.softonic.com/找到。 - 在摄像机正下方 5-7 mm 处使用夹子修复 850 nm ± 3 nm 带通滤镜。
注: 滤镜直径约2.5厘米,相机镜头直径小于1厘米,因此滤镜可以覆盖相机的视野。使用相机下方的滤镜,不应在 AMcap 的窗口中看到光点。 - 将三个红外光生成 LED(中波长 = 850 nm)均匀地放置在 agar 板周围。每个 LED 应距离 agar 板的边缘约 5 厘米,LED 的镜头面应以 70° 向下角朝向阿加板。通过交流到直流转换器将 LED 连接到电源。
注: 最好修复红外光 LED 的位置和角度,以确保该领域在各种实验试验中的亮度一致性,并方便以后的视频处理。 - 在计算机和设备之间放置一块黑板。设置计算机屏幕的亮度,以防止计算机屏幕光线影响实验。
注: 测量光的波长或强度时,保持环境黑暗。
2. 设置成像参数
- 在 AMcap 软件的菜单上,选择 选项 | 视频设备 | 捕获格式,并将捕获视频的像素大小设置为 800 x 600,帧速率设置为 60 fps。
- 从摄像机下方取出滤镜,在相机下方放置一把尺子,并调整相机对焦,使比例线清晰且与视场的宽度平行。
- 单击 捕获 | 设置 | 视频捕获 以选择保存路径,单击 "开始录制",记录对应于 600 像素的实际距离,并计算每个像素与实际距离的比例。
3. 光避免行为的视频记录
- 通过所有实验保持 25.5 °C 的温度。如有需要,用空调控制室温。使用加湿器将湿度保持在 60%。
- 拍摄名为"光区域1"的光点位置的简短视频。然后,将 850 nm ± 3 nm 滤镜移回以覆盖相机镜头。
注: 在记录幼虫行为时,相机镜头由 850 nm ± 3 nm 滤光片覆盖,以便在视频中不显示光点。光点可以在视频中重建与幼虫以后与马特拉布。不要更改相机的位置,避免更改每个像素与步骤 2.3 中测量的实际距离的比例。 - 打开远离实验装置的灯(即房间灯)。只要用眼睛清楚地看到幼虫,就尽量把光线调低。用勺子将幼虫从培养介质中取出,轻轻采摘三星幼虫,用蒸馏水清洗干净。小心一次洗一个幼虫,以避免饥饿的干扰。一个实验至少需要20个幼虫。
- 在第 1.3 步期间将幼虫转移到放置在相机下方的 agar 板的中心。用刷子轻轻地从幼虫身上取出多余的水,或使用印迹纸去除幼虫中的水,以防止透镜下光线反射。关掉房间的灯,让幼虫在黑暗的环境中适应2分钟。
- 打开LED灯产生红外光,轻轻将幼虫刷到板的中心。当幼虫开始直爬时,旋转板,使幼虫朝向光点。确保它从一开始就直接爬行,否则它可能无法访问光点。
- 单击 捕获 | 设置 | 视频 捕获以选择保存路径,然后单击 "开始录制 "以录制。让幼虫爬向光点,进入光点,然后离开光点,直到它几乎脱离视野。点击 停止录制。如果幼虫在靠近前从光点转离,请直接单击 "停止记录"。
- 将滤镜移离相机。拍摄名为"光区域2"的光点位置的简短视频,并将其与"光区域1"进行比较,以确保光点位置不变。如果观察到明显的位置变化,则丢弃数据。
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Representative Results
图1:实验设置。 (A) 光点基幼虫快速光塔西测定设置的原理图表示。蓝线表示用作视觉刺激的可见光路径,红线表示红外光路径。箭头指示光的方向。850 nm 带通滤镜允许红外光通过,但它会阻挡可见光。(B) 光点测定设置的图像。应当指出,图像是在光线条件下拍摄的,以便更好地可视化。 请单击此处查看此图的更大版本。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |