Световое пятно анализа: метод для расследования Drosophila фототаксическое поведение

Overview

Личинки дрозофилы светочувствительны и реагируют на изменения в окружающем свете. Это видео описывает анализ, который проверяет их способность избегать света, называется световое пятно анализа. Протокол показывает, как настроить анализ с синим светом светодиода и показывает, как записывать поведение животного в ответ на столкновение света.

Protocol

Этот текст протокола является выдержкой из Sun et al., Light Spot-Based Assay для анализа Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Настройка системы визуализации

1. Зажим веб-камеры высокого разрешения с железным зажимом, примерно на 10 см над светлым пятном на рабочем столе(рисунок 1).
2. Отрегулируйте ориентацию объектива камеры в сторону рабочего стола. Подключите камеру к компьютеру через интерфейс USB.
3. Поместите агар-табличку на рабочий стол прямо под камерой.
4. Откройте программное обеспечение "Amcap9.22" на компьютере с Windows 7, и световое пятно будет автоматически показано в окне AMcap. Перемести камеру немного влево или вправо, чтобы убедиться, что световое пятно находится вблизи центра окна. Убедитесь, что камера не блокирует путь света. Световое пятно должно быть полным и круглым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение можно найти на http://amcap.en.softonic.com/.
5. Зафиксните 850 нм ± 3 нм диапазон-проходный фильтр с клипом на 5-7 мм прямо под камерой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр фильтра составляет около 2,5 см, а объектив камеры меньше 1 см в диаметре, поэтому фильтр может покрывать поле зрения камеры. С фильтром под камерой, световое пятно не должно быть видно в окне AMcap.
6. Поместите три инфракрасно-световых светодиода (центральная длина волны 850 нм) равномерно вокруг агар-пластины. Каждый светодиод должен быть около 5 см от края агар пластины, и лицо объектива светодиода должно быть на 70 "вниз угол к агар пластины. Подключите светодиоды к мощности с помощью преобразователь переменного тока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше зафиксировать положения и углы светодиодов инфракрасного света, чтобы обеспечить консистенцию яркости поля в различных экспериментальных испытаниях и облегчить более зже обработку видео.
7. Поместите черную доску между компьютером и устройством. Установите яркость экрана компьютера, чтобы предотвратить свет экрана компьютера от воздействия эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите окружающую среду темной при измерении длины волны или интенсивности света.

2. Установка параметров изображения

1. В меню программного обеспечения AMcap выберите варианты | Видео устройства | Формат захватаи установить размер пикселя захваченного видео до 800 х 600 и частота кадров до 60 кадров в минуту.
2. Удалите фильтр из-под камеры, положите линейку под камеру и отрегулируйте фокус камеры, чтобы линия масштаба была ясной и параллельной ширине поля зрения видео.
3. Нажмите Захват | Настройка | Видео захвата, чтобы выбрать путь сохранения, нажмите Начало записи,запись фактического расстояния, соответствующего 600 пикселей, и рассчитать соотношение каждого пикселя к фактическому расстоянию.

3. Видеозапись поведения избегания света

1. Поддерживайте температуру 25.5 C через все эксперименты. При необходимости контроли комнатной температуры с помощью кондиционера. Держите влажность постоянно на 60% с увлажнителем.
2. Возьмите короткое видео положения светового пятна под названием "lightarea1". Затем переместите фильтр 850 нм ± 3 нм назад, чтобы покрыть объектив камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При записи личинок объектив камеры покрывается фильтром 850 нм ± 3 нм, чтобы световое пятно не было показано на видео. Световое пятно может быть реконструировано на видео с личинками позже с Matlab. Не изменяйте положение камеры и избегайте изменения соотношения каждого пикселя к фактическому расстоянию, измеряемому в шаге 2.3.
3. Включите свет (т.е. комнатный свет) далеко от экспериментального устройства. Выключите свет как можно меньше, пока личинки хорошо видны глазами. Возьмите личинки из среды культуры ложкой, аккуратно выберите личинку третьей в звезде и вымойте ее чистой дистиллированной водой. Будьте осторожны, чтобы вымыть личинки по одному, чтобы избежать вмешательства от голода. Для одного эксперимента требуется не менее 20 личинок.
4. Перенесите личинку в центр агарной пластины, помещенной под камеру во время шага 1.3. Аккуратно удалите излишки воды из личинки с помощью кисти или используйте бумагу для удаления воды из личинки, чтобы предотвратить отражение света под объективом. Выключите свет комнаты и дайте личинке акклиматизироваться в течение 2 минут в темной среде.
5. Включите светодиодный свет для генерации инфракрасного света и аккуратно почистите личинку к центру пластины. Когда личинка начинает ползать прямо, поверните пластину, чтобы личинка голову к светлому месту. Убедитесь, что он ползет прямо с самого начала, иначе он не может получить доступ к светлому месту.
6. Нажмите Захват | Настройка | Видео захвата, чтобы выбрать путь сохранения, а затем нажмите Начало записи для записи. Разрешить личинки ползать к светлому пятно, войти в светлое пятно, а затем оставить световое пятно, пока он почти из поля зрения. Нажмите Остановить запись. Если личинка отворачивается от светового пятна перед тем, как подойти близко, нажмите кнопку Остановить запись.
7. Перемести фильтр от камеры. Возьмите короткое видео положения светового пятна под названием "lightarea2" и сравните его с "lightarea1", чтобы гарантировать, что положение светового пятна не изменилось. Если наблюдается очевидное изменение позиции, отбросьте данные.

Representative Results

Рисунок 1: Экспериментальная настройка. (A) Схематическое представление настройки для легкого пятна на основе личинок быстро фототаксис анализа. Синие линии представляют пути видимого света, используемого в качестве визуальной стимуляции, а красные линии представляют пути инфракрасного света. Стрелки указывают направление света. Фильтр диапазона 850 нм позволяет инфракрасному свету проходить, но блокирует видимый свет. (B)Изображение настройки для анализа светового пятна. Следует отметить, что изображение было принято в условиях освещения для лучшей визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%