라이트 스팟 분석: 드로소필라 포토전술 행동을 조사하는 방법

Overview

드로소필라 애벌레는 빛에 민감하며 주변 빛의 변화에 반응합니다. 이 비디오는 광점 분석이라고 불리는 빛을 피하는 능력을 테스트하는 분석서를 설명합니다. 이 프로토콜은 청색 광 LED로 분석법을 설정하는 방법을 보여 주며 빛의 만남에 대한 응답으로 동물의 행동을 기록하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜 텍스트는 Sun 외., 드로소필라 라발 포토탁시스, J. Vis. Exp. (2019)의 분석을 위한 라이트 스팟 기반 분석에서 발췌한 것입니다.

1. 이미징 시스템의 설정

1. 데스크탑의 라이트 스팟 에서 약 10cm 높이에서 철 클립으로 고해상도 웹 카메라를 고정합니다(그림1).
2. 카메라 렌즈의 방향을 바탕 화면쪽으로 조정합니다. USB 인터페이스를 통해 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
3. 카메라 바로 아래 바탕 화면에 한천 접시를 놓습니다.
4. Windows 7이 있는 컴퓨터에서 "Amcap9.22" 소프트웨어를 열고 라이트 스팟이 AMcap 창에 자동으로 표시됩니다. 카메라를 왼쪽 또는 오른쪽으로 약간 이동하여 라이트 스팟이 창 중앙 근처에 있는지 확인합니다. 카메라가 라이트 경로를 차단하지 않도록 합니다. 라이트 스팟은 완전하고 둥글게 만들어야 합니다.
   참고: 이 소프트웨어는 http://amcap.en.softonic.com/에서 찾을 수 있습니다.
5. 카메라 바로 아래 5-7mm의 클립으로 850 nm ± 3 nm 밴드 패스 필터를 수정합니다.
   참고: 필터의 직경은 약 2.5cm이며 카메라 렌즈의 직경은 1cm 미만이므로 필터가 카메라의 시야를 덮을 수 있습니다. 카메라 아래의 필터를 사용하면 AMcap 창에서 라이트 스팟을 볼 수 없습니다.
6. 3개의 적외선 광 발생 LED(중앙 파장 = 850 nm)를 한천 판 주위에 고르게 놓습니다. 각 LED는 한천 판가장자리에서 약 5cm 떨어져 있어야 하며 LED의 렌즈 면은 한천 판쪽으로 70° 아래쪽 각도여야 합니다. AC-DC 컨버터를 통해 LED를 전원에 연결합니다.
   참고: 적외선 LED의 위치와 각도를 수정하여 다양한 실험 시험에서 필드의 밝기의 일관성을 보장하고 이후 비디오 처리를 용이하게하는 것이 좋습니다.
7. 컴퓨터와 장치 사이에 블랙보드를 놓습니다. 컴퓨터 화면의 밝기를 설정하여 컴퓨터 화면 표시등이 실험에 영향을 주지 않도록 합니다.
   참고: 빛의 파장이나 강도를 측정할 때 환경을 어둡게 유지합니다.

2. 이미징의 매개 변수 설정

1. AMcap 소프트웨어 의 메뉴에서 옵션을 선택 | 비디오 장치 | 캡처 형식을 캡처하고캡처된 비디오의 픽셀 크기를 800 x 600으로 설정하고 프레임 속도를 60fps로 설정합니다.
2. 카메라 아래에서 필터를 제거하고 카메라 아래에 눈자를 배치하고 카메라 포커스를 조정하여 스케일 라인을 비디오 시야의 너비와 선명하고 평행하게 만듭니다.
3. 캡처 | 클릭 | 설정 비디오 캡처를 사용하여 저장 경로를 선택하고, 녹화 시작을클릭하고, 600픽셀에 해당하는 실제 거리를 기록하고, 각 픽셀의 비율을 실제 거리까지 계산합니다.

3. 빛 회피 행동의 비디오 녹화

1. 모든 실험을 통해 25.5 °C의 온도를 유지합니다. 필요한 경우 에어컨으로 실내 온도를 제어합니다. 가습기로 지속적으로 습도를 60%로 유지하십시오.
2. "lightarea1"이라는 라이트 스팟 위치의 짧은 비디오를 촬영합니다. 그런 다음 850 nm ± 3 nm 필터를 다시 이동하여 카메라 렌즈를 덮습니다.
   참고: 애벌레 동작을 기록할 때 카메라 렌즈는 850 nm ± 3 nm 필터로 덮여 있어 영상에 라이트 스팟이 표시되지 않습니다. 라이트 스팟은 나중에 Matlab과 함께 애벌레와 함께 비디오에서 재구성 할 수 있습니다. 카메라의 위치를 변경하지 말고 각 픽셀의 비율을 2.3 단계에서 측정된 실제 거리로 변경하지 마십시오.
3. 실험 장치에서 멀리 떨어진 빛(즉, 방 조명)을 켭니다. 애벌레가 눈으로 명확하게 볼 수있는 한 가능한 한 낮은 빛을 거절하십시오. 애벌레를 숟가락으로 배양 배지에서 꺼내서 세 번째 인스타 애벌레를 부드럽게 골라 증류수로 깨끗하게 씻습니다. 굶주림의 간섭을 피하기 위해 한 번에 하나씩 애벌레를 씻으시기 마십시오. 단일 실험은 적어도 20 개의 애벌레가 필요합니다.
4. 1.3단계에서 카메라 아래에 놓인 한천판의 중심으로 애벌레를 옮는다. 브러쉬로 애벌레에서 여분의 물을 부드럽게 제거하거나 블롯 페이퍼를 사용하여 애벌레에서 물을 제거하여 렌즈 아래의 빛의 반사를 방지합니다. 방 의 빛을 끄고 애벌레가 어두운 환경에서 2 분 동안 적응할 수 있도록합니다.
5. LED 라이트를 켜서 적외선을 생성하고 애벌레를 플레이트 중앙으로 부드럽게 브러시합니다. 애벌레가 똑바로 기어 다니기 시작하면 접시를 회전하여 유충이 광반쪽으로 향하게 합니다. 처음부터 바로 크롤링되거나 라이트 스팟에 액세스하지 못할 수 있는지 확인합니다.
6. 캡처 | 클릭 | 설정 비디오 캡처를 클릭하여 저장 경로를 선택한 다음 녹화 시작을 클릭하여 녹화를 시작합니다. 애벌레가 광반쪽으로 기어 다니고, 광반으로 들어간 다음, 시야에서 거의 벗어날 때까지 라이트 스팟을 둡니다. 녹화 중지를클릭합니다. 애벌레가 가까워지기 전에 라이트 스팟에서 외면하는 경우, 직접 레코딩 중지를클릭합니다.
7. 필터를 카메라에서 멀리 이동합니다. "lightarea2"라는 라이트 스팟의 위치를 짧은 비디오를 찍고 라이트 스팟 위치가 변경되지 않도록 "lightarea1"과 비교합니다. 명백한 위치 변경이 관찰되면 데이터를 삭제합니다.

Representative Results

그림 1: 실험적인 설정. (A)광스팟 기반 의 애벌레 빠른 포토택시 분석용 셋업의 회로도 표현. 파란색 선은 시각적 자극으로 사용되는 가시광선의 경로를 나타내며 빨간색 선은 적외선의 경로를 나타냅니다. 화살표는 빛의 방향을 나타냅니다. 850 nm 밴드 패스 필터는 적외선을 통과할 수 있지만 가시광선을 차단합니다. (B)광점 분석용 셋업의 이미지. 더 나은 시각화를 위해 이미지가 가벼운 조건에서 촬영되었다는 점에 유의해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%