אור ספוט Assay: שיטה לחקור התנהגות פוטוטאקטית Drosophila

Overview

זחלי דרוזופילה רגישים לאור ומגיבים לשינויים באור שמסביב. סרטון זה מתאר בדיקה הבדוקה את יכולתם להימנע מאור, הנקראת בדיקת נקודת האור. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר את התסעפות עם נורית אור כחול ומראה כיצד לתעד את התנהגות החיה בתגובה למפגש האור.

Protocol

טקסט פרוטוקול זה הוא קטע מתוך שמש ואח ', אור ספוט מבוסס Assay לניתוח של דרוזופילה Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. הגדרת מערכת ההדמיה

1. מהדקים מצלמת אינטרנט ברזולוציה גבוהה עם קליפ ברזל, בגובה של כ-10 ס"מ מעל נקודת האור בשולחן העבודה (איור 1).
2. כוונן את כיוון עדשת המצלמה לכיוון שולחן העבודה. חבר את המצלמה למחשב באמצעות ממשק USB.
3. הנח צלחת אגר על שולחן העבודה ממש מתחת למצלמה.
4. פתח את תוכנת "Amcap9.22" במחשב עם Windows 7, ואת נקודת האור יוצג באופן אוטומטי בחלון של AMcap. הזז את המצלמה מעט שמאלה או ימינה כדי לוודא שנפוט האור נמצא ליד מרכז החלון. ודא שהמצלמה אינה חוסמת את נתיב האור. נקודת האור צריכה להיות שלמה ועגולה.
   שים לב: התוכנה ניתן למצוא http://amcap.en.softonic.com/.
5. תקן מסנן מעבר פס של 850 ננומטר ± 3 ננומטר עם קליפ ב- 5-7 מ"מ ממש מתחת למצלמה.
   שים לב: קוטרו של המסנן הוא כ-2.5 ס"מ, וקוטרו של עדשת המצלמה פחות מ-1 ס"מ, כך שהמסנן יכול לכסות את שדה הראייה של המצלמה. עם המסנן מתחת למצלמה, אין לראות את נקודת האור בחלון של AMcap.
6. מניחים שלוש נוריות יוצרות אור אינפרא אדום (אורך גל מרכזי = 850 ננומטר) באופן שווה סביב צלחת אגר. כל נורית צריכה להיות במרחק של כ-5 ס"מ מקצה צלחת הגר, ופני העדשה של הנורית צריכים להיות בזווית של 70 מעלות כלפי מטה לכיוון צלחת הגר. חבר את נוריות ה- LED לחשמל באמצעות ממיר AC-ל- DC.
   שים לב: עדיף לתקן את המיקומים והזוויות של נוריות אור אינפרא אדום כדי להבטיח עקביות של בהירות השדה בניסויים ניסיוניים שונים להקל על עיבוד וידאו מאוחר יותר.
7. שים לוח שחור בין המחשב להתקן. הגדר את הבהירות של מסך המחשב כדי למנוע מאור המסך של המחשב להשפיע על הניסוי.
   שים לב: שמור על הסביבה כהה בעת מדידת אורך הגל או עוצמת האור.

2. הגדרת פרמטרים של דימות

1. בתפריט של תוכנת AMcap, בחר אפשרויות | | של התקן וידאו לכוד תבניתוהגדר את גודל הפיקסל של הווידאו שנלכד ל- 800 x 600 ואת קצב המסגרות ל- 60 fps.
2. הסר את המסנן מתחת למצלמה, הצב סרגל מתחת למצלמה והתאם את מוקד המצלמה כדי להבהיר את קו קנה המידה ומקביל לרוחב שדה הווידאו של התצוגה.
3. לחץ על | לכידה הגדרת | לכידת וידאו לבחירת נתיב השמירה, לחץ על התחל הקלטה, הקלט את המרחק הממשי המתאים ל- 600 פיקסלים וחשב את היחס בין כל פיקסל למרחק הממשי.

3. הקלטת וידאו של התנהגות הימנעות אור

1. לשמור על טמפרטורה של 25 °C (69 °F) דרך כל הניסויים. בקרה על טמפרטורת החדר עם מזגן במידת הצורך. שמור על הלחות כל הזמן ב 60% עם מכשיר אדים.
2. צלם סרטון קצר של מיקום נקודת האור בשם "lightarea1". לאחר מכן, להזיז את 850 ננומטר ± 3 ננומטר מסנן בחזרה כדי לכסות את עדשת המצלמה.
   שים לב: בעת הקלטת התנהגות הזחל, עדשת המצלמה מכוסה על ידי מסנן 850 ננומטר ± 3 ננומטר, כך נקודת האור אינו מוצג בסרטון. ניתן לשחזר את נקודת האור בסרטונים עם זחלים מאוחר יותר עם Matlab. אל תשנה את מיקום המצלמה, והימנע משינוי היחס בין כל פיקסל למרחק הנמדד בפועל בשלב 2.3.
3. הדליקו אור (כלומר, אור חדר) הרחק מהמכשיר הניסיוני. להנמיך את האור נמוך ככל האפשר, כל עוד הזחלים ניתן לראות בבירור עם העיניים. מוציאים את הזחלים מהמדיום התרבותי עם כפית, בוחרים בעדינות זחל שלישי, ושוטפים אותו במים מזוקקים. היזהר לשטוף זחלים אחד בכל פעם, כדי למנוע הפרעה מרעב. ניסוי אחד דורש לפחות 20 זחלים.
4. מעבירים את הזחל למרכז צלחת הגר הממוקמת מתחת למצלמה במהלך שלב 1.3. יש להסיר בעדינות מים עודפים מהזחל באמצעות מברשת או להשתמש בנייר סופג כדי להסיר מים מהזחל כדי למנוע השתקפות של אור מתחת לעדשה. כבה את אור החדר ואפשר לזחל להתאקלם במשך 2 דקות בסביבה החשוכה.
5. הדליקו את נורית ה-LED כדי ליצור אור אינפרא אדום, וצחצחו בעדינות את הזחל למרכז הצלחת. כאשר הזחל מתחיל לזחול ישר, לסובב את הצלחת כדי להפוך את הזחל ראש לכיוון נקודת האור. ודא שהוא סורק ישירות מההתחלה, אחרת ייתכן שהוא לא יקבל גישה לנקודת האור.
6. לחץ על | לכידה הגדרת | לכידת וידאו כדי לבחור את נתיב השמירה ולאחר מכן לחץ על התחל הקלטה להקלטה. אפשר לזחל לזחול לכיוון נקודת האור, הזן את נקודת האור ולאחר מכן השאר את נקודת האור עד שהיא כמעט מחוץ לשדה הראייה. לחץ על הפסק הקלטה. אם הזחל מתרחק מנקודת האור לפני שהוא מתקרב, לחץ ישירות על עצור הקלטה.
7. הרחק את המסנן מהמצלמה. קח וידאו קצר של המיקום של נקודת האור בשם "lightarea2" ולהשוות אותו "lightarea1" כדי להבטיח כי מיקום נקודת האור לא השתנה. אם נצפה שינוי מיקום ברור, מחק את הנתונים.

Representative Results

איור 1: הגדרה ניסיונית. (A)ייצוג סכמטי של ההגדרה עבור המזחלת המהירה מבוססת כתמי האור. הקווים הכחולים מייצגים את נתיבי האור הנראה המשמשים כגירוי חזותי, והקווים האדומים מייצגים את הנתיבים של אור אינפרא אדום. החצים מציינים את כיוון האור. מסנן מעבר הפס של 850 ננומטר מאפשר לאור אינפרא-אדום לעבור, אך הוא חוסם אור נראה לעין. (B)תמונה של ההגדרה עבור הנקודה האור assay. יש לציין כי התמונה צולמה בתנאי תאורה להדמיה טובה יותר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%