Işık Noktası Tahlili: Drosophila Fototaktik Davranışını Araştırmak İçin Bir Yöntem

Overview

Drosophila larvaları ışığa duyarlıdır ve çevredeki ışıktaki değişikliklere yanıt verir. Bu videoda, ışık noktası testi adı verilen ışıktan kaçınma yeteneklerini test eden bir test açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, tahlilin mavi ışık LED'i ile nasıl ayarılacağını gösterir ve ışık karşılaşmasına yanıt olarak hayvanın davranışının nasıl kaydedildiğini gösterir.

Protocol

Bu protokol metni, Drosophila Larval Phototaxis Analizi için Işık Noktası Tabanlı Tahlil, J. Vis. Exp. (2019) sun ve ark.'dan bir alıntıdır.

1. Görüntüleme sisteminin kurulumu

1. Masaüstündeki ışık noktasının yaklaşık 10 cm üzerinde demir klipsli yüksek çözünürlüklü bir web kamerasını kelepçeleyin(Şekil 1).
2. Kamera lensinin masaüstüne doğru yönünü ayarlayın. Kamerayı bir USB arabirimi aracılığıyla bilgisayara bağlayın.
3. Kameranın hemen altındaki masaüstüne bir agar plakası yerleştirin.
4. Windows 7 ile bilgisayarda "Amcap9.22" yazılımını açın, ışık noktası otomatik olarak AMcap penceresinde gösterilecektir. Işık noktasının pencerenin ortasına yakın olduğundan emin olmak için kamerayı hafifçe sola veya sağa hareket ettinin. Kameranın ışık yolunu engellemediğine emin olun. Işık noktası eksiksiz ve yuvarlak olmalıdır.
   NOT: Yazılım http://amcap.en.softonic.com/.
5. 850 nm ± 3 nm bant geçiş filtresini kameranın hemen altında 5-7 mm'lik bir klipsle sabitleyin.
   NOT: Filtrenin çapı yaklaşık 2,5 cm'dir ve kamera lensinin çapı 1 cm'den azdır, böylece filtre kameranın görsel alanını kaplayabilir. Kameranın altındaki filtre ile ışık noktası AMcap'in penceresinde görülmemelidir.
6. Üç kızılötesi ışık üreten LED'i (merkezi dalga boyu = 850 nm) agar plakasının etrafına eşit olarak yerleştirin. Her LED, agar plakasının kenarından yaklaşık 5 cm uzakta olmalı ve LED'in lens yüzü agar plakasına doğru 70 ° aşağı doğru bir açıda olmalıdır. LED'leri AC'den DC'ye dönüştürücü aracılığıyla güce bağlayın.
   NOT: Çeşitli deneysel denemelerde alanın parlaklığının tutarlılığını sağlamak ve daha sonra video işlemeyi kolaylaştırmak için kızılötesi ışık LED'lerinin konumlarını ve açılarını sabitlemek daha iyidir.
7. Bilgisayar ve aygıt arasına siyah bir tahta koyun. Bilgisayar ekran ışığının denemeyi etkilemesini önlemek için bilgisayar ekranının parlaklığını ayarlayın.
   NOT: Işığın dalga boylarını veya yoğunluğunu ölçerken ortamı karanlık tutun.

2. Görüntüleme parametrelerini ayarlama

1. AMcap yazılımının menüsünde Seçenekler | Video Aygıtı | Yakalama formatıve yakalanan videonun piksel boyutunu 800 x 600 ve kare hızını 60 fps olarak ayarlayın.
2. Filtreyi kameranın altından çıkarın, kameranın altına bir cetvel koyun ve ölçek çizgisini net ve video görüş alanının genişliğine paralel hale getirmek için kamera odağını ayarlayın.
3. Yakalama |'ne tıklayın | ayarlama Kaydetme yolunu seçmek için video yakalama, Kaydı başlat'ı tıklatın, 600 piksele karşılık gelen gerçek mesafeyi kaydedin ve her pikselin gerçek mesafeye oranını hesaplayın.

3. Işıktan kaçınma davranışının video kaydı

1. Tüm deneyler boyunca 25,5 °C'lik bir sıcaklığı koruyun. Gerekirse oda sıcaklığını klima ile kontrol edin. Nemi bir nemlendirici ile sürekli% 60'ta tutun.
2. "Lightarea1" adlı ışık noktası konumunun kısa bir videosunu izleyin. Ardından, kamera lensini kapatmak için 850 nm ± 3 nm filtresini geri hareket ettirenin.
   NOT: Larva davranışını kaydederken, kamera lensi 850 nm ± 3 nm filtre ile kaplanır, böylece ışık noktası videoda gösterilmez. Işık noktası daha sonra Matlab ile larvalı videolarda yeniden inşa edilebilir. Kameranın konumunu değiştirmeyin ve her pikselin oranını 2.3 adımında ölçülen gerçek mesafeye değiştirmekten kaçının.
3. Deneysel cihazdan uzakta bir ışığı (yani bir oda ışığını) açın. Larvalar gözlerle açıkça görülebildiği sürece ışığı mümkün olduğunca kısın. Larvaları bir kaşıkla kültür ortamından alın, yavaşça üçüncü bir başlangıç larvası seçin ve damıtılmış suyla temizleyin. Açlıktan paraziti önlemek için larvaları teker teker yıkamaya dikkat edin. Tek bir deney en az 20 larva gerektirir.
4. Larvaları 1.3 adımı sırasında kameranın altına yerleştirilen agar plakasının ortasına aktarın. Bir fırça ile larvadan fazla suyu hafifçe çıkarın veya ışığın mercek altına yansımasını önlemek için larvadan suyu çıkarmak için şişkin kağıt kullanın. Oda ışığını kapatın ve larvaların karanlık ortamda 2 dakika alışmasına izin verin.
5. Kızılötesi ışık oluşturmak için LED ışığını açın ve larvaları plakanın ortasına hafifçe fırçalayın. Larva düz bir şekilde sürünmeye başladığında, larvayı ışık noktasına doğru yönlendirmek için plakayı döndürün. Başlangıçtan itibaren doğrudan gezindiğinden emin olun, aksi takdirde ışık noktasına erişim elde etmenine gerek kalmayabilir.
6. Yakalama |'ne tıklayın | ayarlama Kaydetme yolunu seçmek için video yakalama, ardından Kaydetmek için kaydı başlat'ı tıklatın. Larvaların ışık noktasına doğru sürünmelerine izin verin, ışık noktasına girin, ardından ışık noktasını görüş alanının neredeyse dışına çıkana kadar bırakın. Kaydı durdur 'atıklayın. Larva yaklaşmadan önce ışık noktasından uzaklaşırsa, kaydı durdur 'adoğrudan tıklayın.
7. Filtreyi kameradan uzaklaştırın. "Lightarea2" adlı ışık noktasının konumunun kısa bir videosunu izleyin ve ışık noktası konumunun değişmemesini sağlamak için "lightarea1" ile karşılaştırın. Bariz bir konum değişikliği gözlenirse, verileri atın.

Representative Results

Şekil 1: Deneysel kurulum. (A) Işık nokta bazlı larva hızlı fototaksi tahlili için kurulumun şematik gösterimi. Mavi çizgiler görsel uyarım olarak kullanılan görünür ışığın yollarını, kırmızı çizgiler ise kızılötesi ışığın yollarını temsil eder. Oklar ışığın yönünü gösterir. 850 nm bant geçiş filtresi kızılötesi ışığın geçmesine izin verir, ancak görünür ışığı engeller. (B) Işık noktası tahlili için kurulumun görüntüsü. Görüntünün daha iyi görselleştirme için ışık koşullarında çekildiği unutulmamalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%