ضوء بقعة المقايسة : طريقة للتحقيق في سلوك Drosophila الضوئية

Overview

يرقات الدروزوفيلا حساسة للضوء وتستجيب للتغيرات في الضوء المحيط. يصف هذا الفيديو المقايسة التي تختبر قدرتها على تجنب الضوء، وتسمى المقايسة بقعة الضوء. يوضح البروتوكول المميز كيفية إعداد المقايسة باستخدام LED الضوء الأزرق ويظهر كيفية تسجيل سلوك الحيوان استجابة للقاء الضوء.

Protocol

نص البروتوكول هذا هو مقتطف من Sun et al., ضوء سبوت القائم على المقايسة لتحليل Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. إعداد نظام التصوير

1. المشبك كاميرا ويب عالية الدقة مع مشبك الحديد، في حوالي 10 سم فوق بقعة الضوء على سطح المكتب (الشكل 1).
2. ضبط اتجاه عدسة الكاميرا نحو سطح المكتب. قم بتوصيل الكاميرا بجهاز كمبيوتر من خلال واجهة USB.
3. ضع لوحة أجار على سطح المكتب أسفل الكاميرا مباشرة.
4. افتح برنامج "Amcap9.22" على الكمبيوتر باستخدام Windows 7، وسيتم عرض بقعة الضوء تلقائيا في نافذة AMcap. حرك الكاميرا قليلا إلى اليسار أو اليمين لضمان أن بقعة الضوء قريبة من وسط النافذة. تأكد من أن الكاميرا لا تمنع مسار الضوء. يجب أن تكون بقعة الضوء كاملة ومستديرة.
   ملاحظة: يمكن العثور على البرنامج في http://amcap.en.softonic.com/.
5. إصلاح 850 نانومتر ± 3 نانومتر الفرقة تمرير مرشح مع مقطع في 5-7 ملم الحق تحت الكاميرا.
   ملاحظة: يبلغ قطر الفلتر حوالي 2.5 سم، وقطر عدسة الكاميرا أقل من 1 سم، وبالتالي يمكن للمرشح تغطية المجال البصري للكاميرا. مع عامل التصفية أسفل الكاميرا، لا ينبغي أن ينظر إلى بقعة الضوء في إطار AMcap.
6. ضع ثلاثة مصابيح LED مولدة للأشعة تحت الحمراء (الطول الموجي المركزي = 850 نانومتر) بالتساوي حول لوحة أجار. يجب أن يكون كل LED على بعد حوالي 5 سم من حافة لوحة أجار، وينبغي أن يكون وجه عدسة الصمام في زاوية 70 درجة إلى أسفل نحو لوحة أجار. قم بتوصيل المصابيح بالطاقة من خلال محول AC-to-DC.
   ملاحظة: فمن الأفضل لإصلاح مواقف وزوايا المصابيح ضوء الأشعة تحت الحمراء لضمان اتساق سطوع الميدان في التجارب التجريبية المختلفة وتسهيل معالجة الفيديو في وقت لاحق.
7. وضع لوحة سوداء بين الكمبيوتر والجهاز. تعيين سطوع شاشة الكمبيوتر لمنع ضوء شاشة الكمبيوتر من التأثير على التجربة.
   ملاحظة: الحفاظ على البيئة مظلمة عند قياس الطول الموجي أو كثافة الضوء.

2. وضع معلمات التصوير

1. في قائمة برنامج AMcap، اختر خيارات | | جهاز الفيديو التقاط التنسيق، وتعيين حجم بكسل الفيديو الذي تم التقاطه إلى 800 × 600 ومعدل الإطار إلى 60 إطارا في الثانية.
2. قم بإزالة الفلتر من أسفل الكاميرا ووضع مسطرة تحت الكاميرا وضبط تركيز الكاميرا لجعل خط المقياس واضحا وموازا لعرض حقل عرض الفيديو.
3. انقر على التقاط | إعداد | التقاط الفيديو لتحديد مسار الحفظ، انقر فوق بدء التسجيل،تسجيل المسافة الفعلية المقابلة ل 600 بكسل، وحساب نسبة كل بكسل إلى المسافة الفعلية.

3. تسجيل فيديو لسلوك تجنب الضوء

1. الحفاظ على درجة حرارة 25.5 درجة مئوية من خلال جميع التجارب. التحكم في درجة حرارة الغرفة مع مكيف الهواء إذا لزم الأمر. الحفاظ على الرطوبة باستمرار في 60٪ مع مرطب.
2. التقاط شريط فيديو قصير من موقف بقعة الضوء المسمى "lightarea1". ثم، نقل 850 نانومتر ± 3 نانومتر مرشح مرة أخرى لتغطية عدسة الكاميرا.
   ملاحظة: عند تسجيل سلوك اليرقات ، يتم تغطية عدسة الكاميرا بتصفية 850 نانومتر ± 3 نانومتر بحيث لا تظهر بقعة الضوء في الفيديو. يمكن إعادة بناء بقعة الضوء في مقاطع فيديو مع اليرقات في وقت لاحق مع Matlab. لا تغير موضع الكاميرا، وتجنب تغيير نسبة كل بكسل إلى المسافة الفعلية التي تقاس في الخطوة 2.3.
3. قم بتشغيل ضوء (أي ضوء غرفة) بعيدا عن الجهاز التجريبي. اطفئ الضوء إلى أدنى مستوى ممكن ، طالما يمكن رؤية اليرقات بوضوح بالعينين. أخرج اليرقات من وسط الثقافة بملعقة ، واختر بلطف يرقة نجمة ثالثة ، واغسلها نظيفة بالماء المقطر. يجب الحرص على غسل اليرقات واحدة في كل مرة لتجنب التداخل من الجوع. تتطلب تجربة واحدة ما لا يقل عن 20 يرقة.
4. نقل اليرقة إلى مركز لوحة أغار وضعت تحت الكاميرا خلال الخطوة 1.3. قم بإزالة الماء الزائد برفق من اليرقة باستخدام فرشاة أو استخدم ورق النشاف لإزالة الماء من اليرقة لمنع انعكاس الضوء تحت العدسة. أطفئ ضوء الغرفة واسمح لليرقة بالتأقلم لمدة دقيقتين في البيئة المظلمة.
5. قم بتشغيل ضوء LED لتوليد ضوء الأشعة تحت الحمراء ، وفرشاة اليرقة برفق إلى وسط اللوحة. عندما تبدأ اليرقة في الزحف مباشرة ، قم بتدوير اللوحة لجعل رأس اليرقة نحو بقعة الضوء. تأكد من أنه يزحف مباشرة من البداية، وإلا فإنه قد لا تحصل على الوصول إلى بقعة الضوء.
6. انقر على التقاط | إعداد | التقاط الفيديو لتحديد مسار الحفظ، ثم انقر فوق بدء التسجيل للتسجيل. اسمح لليرقة بالزحف نحو بقعة الضوء ، وأدخل بقعة الضوء ، ثم اترك بقعة الضوء حتى تخرج تقريبا من مجال الرؤية. انقر فوق إيقاف التسجيل. إذا ابتعدت اليرقة عن بقعة الضوء قبل الاقتراب ، فانقر مباشرة فوق إيقاف التسجيل.
7. حرك الفلتر بعيدا عن الكاميرا. خذ مقطع فيديو قصير عن موضع بقعة الضوء المسماة "lightarea2" وقارنها ب "lightarea1" لضمان عدم تغيير موضع بقعة الضوء. في حالة ملاحظة تغيير واضح في الموضع، تجاهل البيانات.

Representative Results

الشكل 1: الإعداد التجريبي. (أ)التمثيل التخطيطي للتشكيلة الخاصة بالقس الضوئي السريع لليرقات المستندة إلى بقعة الضوء. تمثل الخطوط الزرقاء مسارات الضوء المرئي المستخدم حفاز بصري، وتمثل الخطوط الحمراء مسارات ضوء الأشعة تحت الحمراء. تشير الأسهم إلى اتجاه الضوء. يسمح فلتر تمرير النطاق 850 نانومتر للضوء بالأشعة تحت الحمراء بالمرور ، ولكنه يمنع الضوء المرئي. (ب) صورة من الإعداد للتشايس بقعة الضوء. وتجدر الإشارة إلى أن الصورة التقطت في ظل ظروف ضوئية لتحسين التصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%