Light Spot Assay: een methode om drosophila-fototactisch gedrag te onderzoeken

Overview

Drosophila-larven zijn lichtgevoelig en reageren op veranderingen in het omringende licht. Deze video beschrijft een test die hun vermogen om licht te vermijden test, de zogenaamde light spot assay. Het aanbevolen protocol laat zien hoe u de test instelt met een led met blauw licht en laat zien hoe u het gedrag van het dier kunt registreren als reactie op de ontmoeting met het licht.

Protocol

Deze protocoltekst is een fragment uit Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Opzet van het beeldvormingssysteem

1. Klem een webcamera met hoge resolutie vast met een ijzeren klem, op ongeveer 10 cm boven de lichtvlek op het bureaublad (Afbeelding 1).
2. Pas de oriëntatie van de cameralens naar het bureaublad aan. Sluit de camera aan op een computer via een USB-interface.
3. Plaats een agarplaat op het bureaublad direct onder de camera.
4. Open de "Amcap9.22"-software op de computer met Windows 7 en de lichtvlek wordt automatisch weergegeven in het venster van AMcap. Verplaats de camera iets naar links of rechts om ervoor te zorgen dat de lichtvlek zich in de buurt van het midden van het venster bevindt. Zorg ervoor dat de camera het lichtpad niet blokkeert. De lichtvlek moet compleet en rond zijn.
   OPMERKING: De software is te vinden op http://amcap.en.softonic.com/.
5. Bevestig een 850 nm ± 3 nm banddoorlaatfilter met een clip op 5-7 mm direct onder de camera.
   OPMERKING: De diameter van het filter is ongeveer 2,5 cm en de cameralens heeft een diameter van minder dan 1 cm, zodat het filter het gezichtsveld van de camera kan bedekken. Met het filter onder de camera mag de lichtvlek niet te zien zijn in het venster van AMcap.
6. Plaats drie infrarood-lichtgenererende LED's (centrale golflengte = 850 nm) gelijkmatig rond de agarplaat. Elke LED moet zich op ongeveer 5 cm afstand van de rand van de agarplaat bevindt en het lensvlak van de LED moet zich in een neerwaartse hoek van 70° naar de agarplaat bewegen. Sluit de LED's aan op de stroom via de AC-naar-DC converter.
   OPMERKING: Het is beter om de posities en hoeken van de infrarood licht-LED's te bevestigen om consistentie van de helderheid van het veld in verschillende experimentele proeven te garanderen en latere videoverwerking te vergemakkelijken.
7. Plaats een zwart bord tussen de computer en het apparaat. Stel de helderheid van het computerscherm in om te voorkomen dat het lampje van het computerscherm het experiment beïnvloedt.
   OPMERKING: Houd de omgeving donker bij het meten van golflengte of intensiteit van het licht.

2. Parameters van beeldvorming instellen

1. Kies opties | in het menu van de AMcap-software | videoapparaat Leg het formaat vasten stel de pixelgrootte van de vastgelegde video in op 800 x 600 en de framesnelheid op 60 fps.
2. Verwijder het filter van onder de camera, plaats een liniaal onder de camera en pas de scherpstelling van de camera aan om de schaallijn helder en evenwijdig aan de breedte van het video gezichtsveld te maken.
3. Klik op | vastleggen | instellen Video-opname om het opslagpad te selecteren, klikt u op Opname starten,registreert u de werkelijke afstand die overeenkomt met 600 pixels en berekent u de verhouding tussen elke pixel en de werkelijke afstand.

3. Video-opname van lichtvermijdingsgedrag

1. Houd tijdens alle experimenten een temperatuur van 25,5 °C aan. Regel indien nodig de kamertemperatuur met een airconditioner. Houd de luchtvochtigheid constant op 60% met een luchtbevochtiger.
2. Maak een korte video van de positie van de lichtvlek met de naam "lightarea1". Verplaats vervolgens het 850 nm ± 3 nm filter terug om de cameralens te bedekken.
   OPMERKING: Bij het opnemen van larvaal gedrag wordt de cameralens bedekt door het 850 nm ± 3 nm filter, zodat de lichtvlek niet in de video wordt weergegeven. De lichtvlek kan later met Matlab worden gereconstrueerd in video's met larven. Verander de positie van de camera niet en vermijd het wijzigen van de verhouding van elke pixel tot de werkelijke afstand gemeten in stap 2.3.
3. Doe een lampje (d.w.z. een kamerlamp) aan ver weg van het experimentele apparaat. Zet het licht zo laag mogelijk, zolang de larven met de ogen goed te zien zijn. Haal de larven met een lepel uit het kweekmedium, pluk voorzichtig een derde-instar larve en was het schoon met gedestilleerd water. Wees voorzichtig om larve één voor één te wassen om interferentie van honger te voorkomen. Een enkel experiment vereist ten minste 20 larven.
4. Breng de larve over naar het midden van de agarplaat die tijdens stap 1.3 onder de camera is geplaatst. Verwijder voorzichtig overtollig water van de larve met een borstel of gebruik vloeipapier om water van de larve te verwijderen om reflectie van licht onder de lens te voorkomen. Zet het kamerlicht uit en laat de larve 2 minuten acclimatiseren in de donkere omgeving.
5. Schakel het LED-licht in om infrarood licht te genereren en borstel de larve voorzichtig naar het midden van de plaat. Wanneer de larve recht begint te kruipen, draait u de plaat om de larve naar de lichte plek te laten gaan. Zorg ervoor dat het direct vanaf het begin kruipt, anders krijgt het mogelijk geen toegang tot de lichtvlek.
6. Klik op | vastleggen | instellen Video-opname om het opslagpad te selecteren en klik vervolgens op Opname starten om op te nemen. Laat de larve naar de lichtvlek kruipen, betreed de lichtvlek en verlaat de lichtvlek totdat deze bijna uit het gezichtsveld is. Klik op Opname stoppen. Als de larve zich van de lichtvlek afklampt voordat hij in de buurt komt, klikt u direct op Opname stoppen.
7. Plaats het filter uit de buurt van de camera. Maak een korte video van de positie van de lichtvlek met de naam "lightarea2" en vergelijk deze met "lightarea1" om ervoor te zorgen dat de positie van de lichtvlek niet wordt gewijzigd. Als een duidelijke positieverandering wordt waargenomen, verwijdert u de gegevens.

Representative Results

Figuur 1: Experimentele opstelling. (A) Schematische weergave van de opstelling voor de lichte spot-based larvale snelle fototaxis test. De blauwe lijnen vertegenwoordigen de paden van zichtbaar licht die worden gebruikt als visuele stimulatie, en de rode lijnen vertegenwoordigen de paden van infrarood licht. Pijlen geven de richting van het licht aan. Het 850 nm banddoorlaatfilter laat infrarood licht door, maar blokkeert zichtbaar licht. (B) Een afbeelding van de opstelling voor de lichtvlektest. Opgemerkt moet worden dat de afbeelding is genomen onder lichtomstandigheden voor een betere visualisatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%