Light Spot Assay: Eine Methode zur Untersuchung des Phototaktischen Verhaltens von Drosophila

Overview

Drosophila-Larven sind lichtempfindlich und reagieren auf Veränderungen des umgebenden Lichts. Dieses Video beschreibt einen Test, der ihre Fähigkeit testet, Licht zu vermeiden, den Lichtfleck-Assay. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie man den Test mit einer blauen Licht-LED aufstellt und zeigt, wie man das Verhalten des Tieres als Reaktion auf die Lichtbegegnung aufzeichnet.

Protocol

Dieser Protokolltext ist ein Auszug aus Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Aufbau des Bildgebungssystems

1. Klemmen Sie eine hochauflösende Webkamera mit einem Eisenclip, etwa 10 cm über dem Lichtfleck auf dem Desktop (Abbildung 1).
2. Passen Sie die Ausrichtung des Kameraobjektivs zum Desktop an. Schließen Sie die Kamera über eine USB-Schnittstelle an einen Computer an.
3. Legen Sie eine Agar-Platte auf den Desktop direkt unter der Kamera.
4. Öffnen Sie die Software "Amcap9.22" auf dem Computer mit Windows 7, und der Lichtfleck wird automatisch im Fenster von AMcap angezeigt. Bewegen Sie die Kamera leicht nach links oder rechts, um sicherzustellen, dass sich der Lichtfleck in der Nähe der Mitte des Fensters befindet. Stellen Sie sicher, dass die Kamera den Lichtpfad nicht blockiert. Der Lichtfleck sollte vollständig und rund sein.
   HINWEIS: Die Software finden Sie unter http://amcap.en.softonic.com/.
5. Befestigen Sie einen 850 nm ± 3 nm Bandpassfilter mit einem Clip bei 5-7 mm direkt unter der Kamera.
   HINWEIS: Der Durchmesser des Filters beträgt ca. 2,5 cm, und das Kameraobjektiv hat einen Durchmesser von weniger als 1 cm, so dass der Filter das Gesichtsfeld der Kamera abdecken kann. Mit dem Filter unter der Kamera sollte der Lichtfleck nicht im Fenster von AMcap gesehen werden.
6. Platzieren Sie drei infrarot-lichterzeugende LEDs (zentrale Wellenlänge = 850 nm) gleichmäßig um die Agarplatte. Jede LED sollte etwa 5 cm vom Rand der Agarplatte entfernt sein, und die Linsenfläche der LED sollte in einem 70° Abwärtswinkel zur Agarplatte liegen. Schließen Sie die LEDs über den AC-zu-DC-Wandler an die Stromversorgung an.
   HINWEIS: Es ist besser, die Positionen und Winkel der Infrarotlicht-LEDs zu fixieren, um die Konsistenz der Helligkeit des Feldes in verschiedenen experimentellen Versuchen zu gewährleisten und spätere Videoverarbeitung zu erleichtern.
7. Setzen Sie eine schwarze Platine zwischen den Computer und das Gerät. Legen Sie die Helligkeit des Computerbildschirms fest, um zu verhindern, dass das Bildschirmlicht des Computers das Experiment beeinflusst.
   HINWEIS: Halten Sie die Umgebung dunkel, wenn Sie Wellenlänge oder Intensität des Lichts messen.

2. Einstellen von Parametern der Bildgebung

1. Wählen Sie im Menü der AMcap-Software Optionen | Videogerät | Erfassen Sie das Format, und legen Sie die Pixelgröße des aufgenommenen Videos auf 800 x 600 und die Bildrate auf 60 fps fest.
2. Entfernen Sie den Filter unter der Kamera, legen Sie ein Lineal unter die Kamera und passen Sie den Kamerafokus an, um die Skalierungslinie klar und parallel zur Breite des Videofelds zu machen.
3. Klicken Sie auf Capture | Einrichten | Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen, klicken Sie auf Aufnahme starten, zeichnen Sie den tatsächlichen Abstand von 600 Pixelaufzeichnen und berechnen Sie das Verhältnis jedes Pixels zur tatsächlichen Entfernung.

3. Videoaufzeichnung des Lichtvermeidungsverhaltens

1. Halten Sie eine Temperatur von 25,5 °C durch alle Experimente. Kontrollraumtemperatur bei Bedarf mit einer Klimaanlage. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit mit einem Luftbefeuchter konstant bei 60%.
2. Nehmen Sie ein kurzes Video der Lichtfleckposition namens "lightarea1". Bewegen Sie dann den 850 nm ± 3 nm Filter zurück, um das Kameraobjektiv zu bedecken.
   HINWEIS: Bei der Aufnahme des Larvenverhaltens wird das Kameraobjektiv mit dem 850 nm ± 3 nm Filter abgedeckt, so dass der Lichtfleck nicht im Video angezeigt wird. Der Lichtfleck kann später mit Matlab in Videos mit Larven rekonstruiert werden. Ändern Sie nicht die Position der Kamera, und vermeiden Sie es, das Verhältnis jedes Pixels zu dem tatsächlichen Abstand zu ändern, der in Schritt 2.3 gemessen wird.
3. Schalten Sie ein Licht (d. h. ein Raumlicht) weit weg vom Versuchsgerät ein. Schalten Sie das Licht so niedrig wie möglich, solange die Larven deutlich mit den Augen zu sehen sind. Die Larven mit einem Löffel aus dem Kulturmedium nehmen, vorsichtig eine Third-Instar-Larve pflücken und mit destilliertem Wasser reinigen. Achten Sie darauf, Larven nacheinander zu waschen, um Störungen durch Hunger zu vermeiden. Ein einzelnes Experiment erfordert mindestens 20 Larven.
4. Übertragen Sie die Larve in die Mitte der Agarplatte, die während Schritt 1.3 unter der Kamera platziert wird. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Wasser aus der Larve mit einer Bürste oder verwenden Sie Blotpapier, um Wasser aus der Larve zu entfernen, um eine Reflexion von Licht unter der Linse zu verhindern. Schalten Sie das Raumlicht aus und lassen Sie die Larve für 2 min in der dunklen Umgebung zu akklimatisieren.
5. Schalten Sie das LED-Licht ein, um Infrarotlicht zu erzeugen, und bürsten Sie die Larve vorsichtig in die Mitte der Platte. Wenn die Larve gerade zu kriechen beginnt, drehen Sie die Platte, um die Larve in Richtung des Lichtflecks zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass es direkt von Anfang an kriecht, sonst erhält es keinen Zugriff auf den Lichtfleck.
6. Klicken Sie auf Capture | Einrichten | Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen, und klicken Sie dann auf Aufnahme starten, um aufzunehmen. Lassen Sie die Larve in Richtung des Lichtflecks kriechen, betreten Sie den Lichtfleck und lassen Sie dann den Lichtfleck, bis er fast aus dem Sichtfeld heraus ist. Klicken Sie auf Aufzeichnung beenden. Wenn sich die Larve vor dem Näherungsvorgang vom Lichtfleck abwendet, klicken Sie direkt auf Aufnahme beenden.
7. Bewegen Sie den Filter von der Kamera weg. Nehmen Sie ein kurzes Video von der Position des Lichtflecks namens "lightarea2" und vergleichen Sie ihn mit "lightarea1", um sicherzustellen, dass die Lichtfleckposition nicht geändert wird. Wenn eine offensichtliche Positionsänderung beobachtet wird, verwerfen Sie die Daten.

Representative Results

Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Schematische Darstellung des Aufbaus für den leichten, punktbasierten Larven-Schnell-Phototaxis-Assay. Die blauen Linien stellen die Pfade des sichtbaren Lichts dar, die als visuelle Stimulation verwendet werden, und die roten Linien stellen die Pfade des Infrarotlichts dar. Pfeile zeigen die Richtung des Lichts an. Der 850 nm Bandpassfilter lässt Infrarotlicht passieren, blockiert aber sichtbares Licht. (B) Ein Bild des Setups für den Lichtfleck-Assay. Es sollte beachtet werden, dass das Bild unter Lichtbedingungen für eine bessere Visualisierung aufgenommen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%