ג. אלגנס ניתוח בלאסטר: שיטה להסרת קליפת הביצה ולניתוק תאים עובריים

Overview

וידאו זה מציג שיטה של בידוד C. elegans blastomeres מעוברים מוקדמים.  התאים המתקבלים מתאימים לתרבות התאים או לניסויים ex vivo.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Hsu et al,   אין ויטרו שחזור של דפוסי מגע תא מרחבי עם elegans קנורהאבדיטיס מבודדים בלסטרומרים עובר וחרוזים פוליסטירן דבק, J. Vis. Exp. (2019).

1. בידוד של בלדום עוברי
2. ללבוש כפפות וחלוק מעבדה כדי למנוע חתך ומגע עם פתרון הלבנה.
   1. החזק כל קצה של מיקרו-קפילארי (קיבולת; 10 μL) ביד ימין ושמאל.
   2. משוך את המיקרו-קפילארי לכיוון שני הקצוות כדי להפעיל מתח ולהביא את מרכז הנימים מעל מבער כדי ליצור שני נימים שנמשכו ביד(איור 1A).
   3. חותכים את קצות הנימים שנמשכו ביד עם מלקחיים מתחת למיקרוסקופ הנתוח ומחברים את נימי משך לתוך מנגנון צינור הפה. הכינו שני סוגים של פיפטות. גודל פתיחת הקצה עבור הפיפטות צריך להיות כ 2x ו 1x אורך הציר הקצר של C. עוברי אלגנס (30 מיקרומטר) עבור העברת העובר והסרת קליפת הביצה, בהתאמה איור 1B-D).
   4. פיפט 45 μL של תמיסת מלח ביצה על באר של שקופית multiwell (איור 2A; למטה).
   5. מניחים 5-10 בוגרים C. elegans על באר המכילה תמיסת מלח ביצה.
   6. כדי להשיג עוברי C. elegans מוקדמים, חותכים מבוגרים לחתיכות על ידי הצבת שני מחטים מימין ומשמאל לגוף C. elegans והחלקת המחטים זה על פני זה (איור 2A; שרטוטים עליונים).
   7. פיפט 45 μL של פתרון hypochlorite על באר ליד הבאר המכילה תמיסת מלח ביצה (איור 2B).
   8. פיפט 45 μL של מדיום הצמיחה של שלטון על שלוש הבארות ליד הבאר המכילה פתרון hypochlorite (איור 2B).
   9. העבר שלב של תא אחד ועוברי שלב 2 תאים מוקדמים לתמיסת ההיפוכלוריט באמצעות צינור בפה עם נימי מצויר ביד להעברת עוברים (איור 2B).
   10. חכו 40-55 שניות.
   11. שטפו את העוברים על ידי העברת העוברים מתמיסת היפוכלוריט למדיום הגדילה של שלטון באמצעות צינור בפה עם נימי מצויר ביד להעברת עוברים (איור 2B).
   12. שטפו שוב את העוברים על ידי העברת העוברים לבאר חדשה של מדיום הצמיחה של שלטון בפה עם נימי מצויר ביד להעברת עוברים (איור 2B).
   13. להעביר את העוברים שטופים לתוך באר חדשה של מדיום הצמיחה של שלטון על ידי צינור בפה עם נימי מצויר ביד להעברת עובר. באמצעות נימי מצויר ביד להסרת קליפת ביצים, חזור בזהירות על הצינור (איור 2C; שרטוטים אמצעיים). אם קליפת הביצה תוסר בהצלחה, התאים העובריים יהפכו כדוריים יותר (איור 2C; ימין).
   14. הפרד את בלאסטרים עובריים שלב 2 תאים על ידי צינור בעדינות רציפה עם נימי מצויר ביד להסרת קליפת ביצים (איור 2D).

איור 1: בידוד בלדום. (A)משיכת יד של נימי זכוכית. (B)נימי זכוכית מצוירים ביד להעברת עוברים. (ג)נימי זכוכית מצוירים ביד להסרת קליפת ביצים. (D) שרטוטים המציגים את הגודל המתאים של פתח נימי להסרת קליפת הביצה. החצים מצביעים על עוברים. סרגלי קנה מידה מראים 100 מיקרומטר.

איור 2: זרימת עבודה של בידוד בלסמורה. (A)ניתוח של בוגר C. elegans במאגר מלח ביצה כדי לקבל עוברים. תצלומים מראים עוברים בשלב 2 תאים ו-4 תאים לפני הסרת קליפת הביצה. (B)טיפול וכביסה היפוכלוריט. (C) שרטוטים מתארים את התזמון המתאים להסרת קליפת ביצים. תצלום מראה עובר שלב 4 תאים לאחר הסרת קליפת ביצים. (ד)הפרדת בלסמורה. תצלום מראה עובר שלב דו-תאי מופרד. גודל החצים ב- C ו- D מציין את הכוחות היחסיים הנדרשים במהלך pipetting. סרגלי קנה המידה מראים 50 מיקרומטר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.