C. elegans Disección blastómero: un método para eliminar la cáscara de huevo y disociar las células embrionarias

Overview

Este video introduce un método para aislar a los blastómeros C. elegans de embriones tempranos.  Las células resultantes son adecuadas para el cultivo celular o experimentos ex vivo.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Hsu et al,   In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp. (2019).

1. Aislamiento del embrión blastomere
2. Use guantes y bata de laboratorio para evitar cortes y contactos con la solución de blanqueo.
   1. Sostenga cada extremo de un microcapilar (capacidad; 10 μL) con mano derecha e izquierda.
   2. Tire del microcapilario hacia ambos extremos para aplicar tensión y llevar el centro del capilar sobre un quemador para hacer dos capilares tirados a mano(Figura 1A).
   3. Recorte las puntas de los capilares tirados a mano con fórceps bajo el microscopio diseccionador y coloque el capilar tirado en un aparato de pipeteo bucal. Prepare dos tipos de pipetas. Los tamaños de apertura de la punta para las pipetas deben ser aproximadamente 2x y 1x la longitud del eje corto de los embriones C. elegans (30 μm) para la transferencia de embriones y la eliminación de cáscara de huevo, respectivamente figura 1B-D).
   4. Pipeta 45 μL de solución de sal de huevo en un pozo de un tobogán multipocillo(Figura 2A;inferior).
   5. Coloque 5-10 C. elegans adultos en una solución de sal de huevo que contenga bien.
   6. Para obtener embriones C. elegans tempranos, corte a los adultos en pedazos colocando dos agujas a la derecha e izquierda del cuerpo de C. elegans y deslizando las agujas entre sí(Figura 2A;esquemas superiores).
   7. Pipeta 45 μL de solución de hipoclorito en un pozo junto al pozo que contiene solución de sal de huevo (Figura 2B).
   8. Pipeta 45 μL del medio de crecimiento de Shelton en los tres pozos posteriores junto al pozo que contiene solución de hipoclorito (Figura 2B).
   9. Transfiera embriones en etapa de 1 célula y etapa temprana de 2 células a la solución de hipoclorito mediante pipeteo bucal con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones(Figura 2B).
   10. Espere 40-55 s.
   11. Lave los embriones transfiriendo los embriones de la solución de hipoclorito al medio de crecimiento de Shelton pipeteando por vía oral con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones (Figura 2B).
   12. Lave los embriones de nuevo transfiriendo los embriones a un nuevo pozo del medio de crecimiento de Shelton por pipeteo bucal con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones(Figura 2B).
   13. Transfiera los embriones lavados a un nuevo pozo del medio de crecimiento de Shelton pipendo por vía oral con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones. Usando el capilar dibujado a mano para la eliminación de cáscara de huevo, repita cuidadosamente el pipeteo(Figura 2C;esquemas medios). Si la cáscara de huevo se elimina con éxito, las células embrionarias se volverán más esféricas(Figura 2C;derecha).
   14. Separe los blastómeros embrionarios de etapa de 2 células pipendo suave y continuamente con el capilar dibujado a mano para la eliminación de cáscara de huevo(Figura 2D).

Figura 1: Aislamiento blastomere. (A) Extracción manual de vidrio capilar. B) Capilar de vidrio dibujado a mano para la transferencia de embriones. (C) Capilar de vidrio dibujado a mano para la eliminación de cáscara de huevo. (D) Esquemas que muestran el tamaño adecuado de la abertura capilar para la eliminación de cáscara de huevo. Las flechas indican embriones. Las barras de escala muestran 100 μm.

Figura 2: Flujo de trabajo de aislamiento blastomere. (A) Disección de C. elegans adultos en tampón de sal de huevo para obtener embriones. Las fotografías muestran embriones de etapa de 2 y 4 células antes de la eliminación de cáscaras de huevo. B) Tratamiento y lavado de hipocloritos. (C) Los esquemas representan el momento adecuado para la eliminación de cáscara de huevo. La fotografía muestra un embrión en etapa de 4 células después de la extracción de cáscara de huevo. (D) Separación blastomere. La fotografía muestra un embrión separado de etapa de 2 células. Los tamaños de las flechas en C y D indican las fuerzas relativas requeridas durante el pipeteo. Las barras de escala muestran 50 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.