C. 埃莱甘斯 爆破切除：去除蛋壳和分离胚胎细胞的方法

Overview

这段视频介绍了一种从早期胚胎中分离 C.elegans 胚胎的方法。 由此产生的细胞适合细胞培养或 前活体 实验。

Protocol

本协议摘自徐等人，   在体外重建空间细胞接触模式与孤立的卡诺哈布迪蒂斯优雅胚胎爆炸体和粘合剂聚苯乙烯珠，J.Vis.Exp.（2019年）。

1. 胚胎胚胎的分离
2. 戴上手套和实验室外套，避免切割和接触漂白溶液。
   1. 用右手和左手握住微胶囊（容量;10 μL）的每一端。
   2. 将微胶囊拉向两端以施加张力，并将毛细骨的中心移到燃烧器上，使两个手拉毛细细丝（图 1A）。
   3. 在解剖显微镜下用钳子修剪手拉毛细管的尖端，并将拉毛细管连接到口腔管道装置中。准备两种类型的移液器。移液器的尖端开口尺寸应约为C. elegans胚胎 （30 μm） 短轴长度的 2 倍和 1 倍，用于胚胎移植和蛋壳去除，分别图 1B-D）。
   4. 派珀特 45 μL 的蛋盐溶液到多井滑梯的井上 （图 2A; 底部）。
   5. 将 5-10 个成人C. elegans放在含有蛋盐溶液的井中。
   6. 为了获得早期的C.elegans胚胎，将成人切成碎片，将两根针放在C.elegans身体的左右两侧，并将针头滑过对方（图2A;上图示意图）。
   7. 将45微升的次氯酸盐溶液输送到含蛋盐溶液旁边的井上（图2B）。
   8. 雪顿生长介质的 Pipette 45μL 到随后的三口井旁边含有次氯酸盐溶液 （图 2B）。
   9. 将1细胞阶段和早期2细胞阶段胚胎通过口腔管道与手绘毛细管进行胚胎移植进入次氯酸盐溶液（图2B）。
   10. 等待40-55s。
   11. 通过将胚胎从次氯酸盐溶液转移到谢尔顿的生长介质中，用手绘毛细管进行胚胎移植（图2B）清洗胚胎。
   12. 通过用手绘毛细管将胚胎移植到谢尔顿生长介质的新井中，再次清洗胚胎（图2B）。
   13. 将洗过的胚胎通过用手绘毛细管管入谢尔顿生长介质的新井中，用于胚胎移植。使用手绘毛细管去除蛋壳，小心地重复吹笛（图2C：中间示意图）。如果蛋壳被成功切除，胚胎细胞将变得更加球形（图2C：右图）。
   14. 通过用手绘毛细管轻轻连续管道分离2细胞阶段胚胎胚胎爆破体，以去除蛋壳（图2D）。

图1：爆破器隔离。（A） 手拉玻璃毛细。（B） 用于胚胎移植的手绘玻璃毛细。（C） 手绘玻璃毛细，用于去除蛋壳。（D） 示意图显示用于去除蛋壳的毛细管开口的适当大小。箭头表示胚胎。比例栏显示 100 μm。

图2：爆炸体隔离工作流程。（A） 在卵盐缓冲器中解剖成年C.elegans以获得胚胎。照片显示蛋壳切除前的2细胞和4细胞阶段胚胎。（B） 次氯酸盐处理和洗涤。（C） 原理图描绘了去除蛋壳的适当时间。照片显示卵壳切除后的4细胞阶段胚胎。（D） 爆破器分离。照片显示一个分离的2细胞阶段胚胎。C 和 D 中的箭头大小表示管道管道过程中所需的相对力。比例栏显示 50 μm。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.