C. elegans Blastomere dissectie: een methode om de eierschaal te verwijderen en embryonale cellen te dissocieren

Overview

Deze video introduceert een methode om C. elegans blastomeren te isoleren van vroege embryo's.  De resulterende cellen zijn geschikt voor celkweek of ex vivo experimenten.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Hsu et al,   In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyree Beads, J. Vis. Exp. (2019).

1. Isolatie van embryoblastomere
2. Draag handschoenen en een laboratoriumjas om snij- en contact met de bleekoplossing te voorkomen.
   1. Houd elk uiteinde van een microcapillair (capaciteit; 10 μL) met de rechter- en linkerhand vast.
   2. Trek het microcapillair naar beide uiteinden om spanning aan te brengen en breng het midden van het haarvat over een brander om twee met de hand getrokken haarvaten te maken (figuur 1A).
   3. Knip de uiteinden van de met de hand getrokken haarvaten met een tang onder de ontleedmicroscoop en bevestig het getrokken capillair in een mondpijpapparaat. Bereid twee soorten pipetten voor. De tipopeningsgroottes voor de pipetten moeten ongeveer 2x en 1x de korte aslengte van C. elegans-embryo's (30 μm) zijn voor de embryotransfer en het verwijderen van de eierschaal, respectievelijk figuur 1B-D).
   4. Pipet 45 μL eizoutoplossing op een put van een multiwell-dia(figuur 2A; bodem).
   5. Plaats 5-10 volwassen C. elegans op een put met eizoutoplossing.
   6. Om vroege C. elegans embryo's te verkrijgen, snijdt u volwassenen in stukken door twee naalden rechts en links van het lichaam van C. elegans te plaatsen en de naalden langs elkaar te schuiven (figuur 2A; bovenste schema's).
   7. Pipet 45 μL hypochlorietoplossing op een put naast de put met eizoutoplossing (figuur 2B).
   8. Pipet 45 μL van het groeimedium van Shelton op de daaropvolgende drie putten naast de put die hypochlorietoplossing bevat (figuur 2B).
   9. Breng embryo's in het 1-celstadium en het vroege 2-celstadium over in de hypochlorietoplossing door middel van mondpijpen met het met de hand getrokken capillair voor embryotransfer (figuur 2B).
   10. Wacht 40-55 s.
   11. Was de embryo's door de embryo's over te brengen van hypochlorietoplossing naar het groeimedium van Shelton via de mond met het met de hand getrokken capillair voor embryotransfer (figuur 2B).
   12. Was de embryo's opnieuw door de embryo's over te brengen in een nieuwe put van shelton's groeimedium door middel van mondpijpen met het met de hand getrokken capillair voor embryotransfer (figuur 2B).
   13. Breng de gewassen embryo's over in een nieuwe put van Shelton's groeimedium door middel van mondpijpen met het met de hand getrokken capillair voor embryotransfer. Gebruik het met de hand getrokken capillair voor het verwijderen van de eierschaal en herhaal voorzichtig de pipetten(figuur 2C; middelste schema's). Als de eierschaal met succes wordt verwijderd, worden de embryonale cellen bolachtiger (figuur 2C; rechts).
   14. Scheid de embryonale blastomeren in 2 cellen door voorzichtig en continu te pipetten met het met de hand getrokken capillair voor het verwijderen van eierschalen (figuur 2D).

Figuur 1: Blastomere isolatie. (A) Handtrekken van glazen capillair. (B) Handgetekend glascapillair voor embryotransfer. (C) Handgetekende glazen capillair voor het verwijderen van eierschalen. (D) Schema's met de juiste grootte van de capillaire opening voor het verwijderen van de eierschaal. Pijlen duiden op embryo's. Schaalbalken tonen 100 μm.

Figuur 2: Blastomere isolatie workflow. (A) Dissectie van volwassen C. elegans in eizoutbuffer om embryo's te verkrijgen. Foto's tonen 2-cel en 4-cel stadium embryo's voor eierschaal verwijdering. (B) Hypochloriet behandeling en wassen. (C) Schema's geven de juiste timing weer voor het verwijderen van eierschalen. De foto toont een embryo van het 4 celstadium na eierschaalverwijdering. (D) Blastomere scheiding. De foto toont een gescheiden embryo van het 2 celstadium. Maten van de pijlen in C en D geven de relatieve krachten aan die nodig zijn tijdens het pipetten. Schaalbalken tonen 50 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.