C. elegans Dissection blastomere: Une méthode pour enlever la coquille d’œuf et dissocier les cellules embryonnaires

Overview

Cette vidéo introduit une méthode d’isolement des blastomères C. elegans à partir d’embryons précoces.  Les cellules qui en résultent conviennent à la culture cellulaire ou à des expériences ex vivo.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Hsu et coll.,   In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp. (2019).

1. Isolement du blastomere embryonnaire
2. Portez des gants et un manteau de laboratoire pour éviter les coupures et les contacts avec la solution de blanchiment.
   1. Tenez chaque extrémité d’un microcapillaire (capacité; 10 μL) avec la main droite et la main gauche.
   2. Tirez le microcapillaire vers les deux extrémités pour appliquer la tension et amener le centre du capillaire sur un brûleur pour faire deux capillaires tirés à la main (Figure 1A).
   3. Coupez les extrémités des capillaires tirés à la main avec des forceps sous le microscope disséquant et fixez le capillaire tiré dans un appareil de tuyautage de bouche. Préparer deux types de pipettes. Les tailles d’ouverture de pointe pour les pipettes devraient être approximativement 2x et 1x la longueur courte d’axe des embryons de C. elegans (30 μm) pour le transfert d’embryon et l’enlèvement de coquille d’oeuf, respectivement figure 1B-D).
   4. Pipette 45 μL de solution de sel d’œuf sur un puits d’une glissade multiwell(figure 2A; fond).
   5. Déposer 5 à 10 C. elegans adultes sur un puits contenant de la solution de sel d’œuf.
   6. Pour obtenir les embryons précoces de C. elegans, coupez les adultes en morceaux en plaçant deux aiguilles à droite et à gauche du corps de C. elegans et en glissant les aiguilles les unes après les autres(figure 2A; schémas supérieurs).
   7. Pipette 45 μL de solution hypochlorite sur un puits à côté du puits contenant la solution de sel d’oeuf (figure 2B).
   8. Pipette 45 μL du milieu de croissance de Shelton sur les trois puits suivants à côté du puits contenant la solution d’hypochlorite (figure 2B).
   9. Transférer les embryons à 1 cellule et les embryons précoces à 2 cellules dans la solution hypochlorite par tuyautage buccaux avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d’embryons (figure 2B).
   10. Attendez 40-55 s.
   11. Laver les embryons en transférant les embryons de la solution hypochlorite dans le milieu de croissance de Shelton par pipetting bouche avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d’embryons (Figure 2B).
   12. Lavez à nouveau les embryons en transférant les embryons dans un nouveau puits du milieu de croissance de Shelton par pipetting de bouche avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d’embryon (figure 2B).
   13. Transférer les embryons lavés dans un nouveau puits du milieu de croissance de Shelton par pipetting bouche avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d’embryons. À l’aide du capillaire dessiné à la main pour l’enlèvement de la coquille d’œuf, répéter soigneusement le pipetage(figure 2C; schémas intermédiaires). Si la coquille d’œuf est enlevée avec succès, les cellules embryonnaires deviendront plus sphériques(figure 2C; droite).
   14. Séparez les blastomères embryonnaires à 2 cellules en les pipetant doucement et continuellement avec le capillaire dessiné à la main pour l’enlèvement de la coquilled’œuf ( figure 2D).

Figure 1 : Isolement des blastomères. (A) Traction à la main du capillaire en verre. (B) Capillaires en verre dessinés à la main pour le transfert d’embryons. (C) Capillaire en verre dessiné à la main pour l’enlèvement de la coquille d’œuf. (D) Schémas montrant la taille appropriée de l’ouverture capillaire pour l’enlèvement de la coquille d’œuf. Les flèches indiquent les embryons. Les barres d’échelle montrent 100 μm.

Figure 2 : Flux de travail d’isolement blastomere. ( A )Dissectionde C. elegans adulte dans le tampon de sel d’oeuf pour obtenir des embryons. Les photographies montrent des embryons à 2 cellules et à 4 cellules avant l’enlèvement de la coquille d’œuf. (B) Traitement hypochlorite et lavage. (C) Les schémas représentent le moment approprié pour l’enlèvement de la coquille d’œuf. La photographie montre un embryon de stade de 4 cellules après l’enlèvement de coquille d’oeuf. (D) Séparation blastomere. La photographie montre un embryon séparé de stade de 2 cellules. Les tailles des flèches en C et D indiquent les forces relatives requises pendant le pipetage. Les barres d’échelle montrent 50 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.