C. 예인대 Blastomere 해부 : 달걀 껍질을 제거하고 배아 세포를 해리하는 방법

Overview

이 비디오는 초기 배아에서 C. elegans blastomeres를 격리하는 방법을 소개합니다.  결과 세포는 세포 배양 또는 전 생체 내 실험에 적합합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Hsu 외에서 발췌,   격리 된 Caenorhabditis elegans 배아 Blastomeres 및 접착 폴리스티렌 구슬, J. Vis. Exp. (2019)와 공간 세포 접촉 패턴의생체로 재구성이다.

1. 배아 블라도미어의 격리
2. 장갑과 실험실 코트를 착용하여 절단및 표백 용액과 접촉하지 않도록 하십시오.
   1. 좌우로 마이크로모세혈관(용량; 10 μL)의 각 끝을 잡습니다.
   2. 긴장을 적용하고 두 손으로 뽑은 모세 혈관(그림 1A)을만들기 위해 버너 위에 모세관의 중심을 가지고 양쪽 끝으로 마이크로 모세관을 당깁니다.
   3. 해부 현미경 의 밑에 집게로 손으로 당겨진 모세 혈관의 끝을 손질하고 입 파이프 팅 장치에 당겨진 모세관을 연결합니다. 두 가지 유형의 파이펫을 준비합니다. 파이펫의 팁 개구부 크기는 배아 이송 및 달걀 껍질 제거를 위한 C. 예레간 배아(30 μm)의 짧은 축 길이의 약 2배 및 1배이어야 하며, 각각 도 1B-D).
   4. 파이펫 45 μL 의 달걀 소금 용액은 멀티웰 슬라이드의 우물에(그림 2A;바닥).
   5. 5-10 성인용 C. 예인자를 계란 소금 용액이 들어 있는 우물에 놓습니다.
   6. 초기 C. 예레간 배아를 얻으려면, C. 예레간 몸의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 배치하고 바늘을 서로 미끄러지게하여 성인을 조각으로 잘라냅니다(그림 2A; 상부 회로도).
   7. 파이펫 45 μL의 하이포클로리트 용액은 계란염 용액을 함유하고 있는 우물 옆에 잘 들어있다(도 2B).
   8. 피펫 45 μL 의 쉘튼의 성장 배지는 하이포클로리트 용액(그림2B)을함유하고 있는 우물 옆에 있는 후속 3개의 우물에 있다.
   9. 배아 전달을 위한 손으로 그린 모세관을 사용하여 입 파이프팅에 의한 1세포 단계 및 초기 2세포 단계 배아를 하이포염소염 용액으로 이송한다(도2B).
   10. 40-55s를 기다립니다.
   11. 배아 전달을 위해 손으로 그린 모세관을 사용하여 구강 파이프를 사용하여 하이포염소용액에서 쉘튼의 성장 배지로 배아를 이송하여 배아를 세척한다(도2B).
   12. 배아 전달을 위해 손으로 그린 모세관으로 입파이프를 통해 쉘튼의 성장 배지의 새로운 우물로 배아를 이송하여 배아를 다시 씻어낸다(도2B).
   13. 세척된 배아를 배아 전이를 위해 손으로 그린 모세관을 입으로 파이프로 입으로 하여 셸튼의 성장 매체의 새로운 우물로 옮겨넣습니다. 달걀 껍질 제거를 위해 손으로 그린 모세관을 사용하여 파이펫팅(도 2C; 중간 회로도)을 조심스럽게 반복하십시오. 달걀 껍질이 성공적으로 제거되면 배아 세포가 더 구형이 됩니다(도 2C; 오른쪽).
   14. 달걀 껍질 제거를 위해 손으로 그린 모세관으로 부드럽고 지속적으로 배아 배아 블라스트미어를분리합니다(도 2D).

그림 1: Blastomere 격리. (A)유리 모세관의 손으로 당기기. (B)배아 전이를 위한 손으로 그린 유리 모세관. (C)달걀 껍질 제거를 위한 손으로 그린 유리 모세관. (D)달걀 껍질 제거를 위한 모세관 개구의 적절한 크기를 나타내는 회로도. 화살표는 배아를 나타냅니다. 스케일 바는 100 μm을 표시합니다.

그림 2: Blastomere 격리 워크플로우. (A)배아를 얻기 위해 계란 소금 완충제에서 성인 C. 예레건의 해부. 사진은 달걀 껍질 제거 전에 2 세포 및 4 세포 단계 배아를 보여줍니다. (B)고가염소 처리 및 세척. (C)회로도는 달걀 껍질 제거에 적합한 타이밍을 묘사한다. 사진은 달걀 껍질 제거 후 4 세포 단계 배아를 보여줍니다. (D)블라토미어 분리. 사진은 분리된 2세포 단계 배아를 보여줍니다. C와 D의 화살표 크기는 파이펫팅 중에 필요한 상대적인 힘을 나타냅니다. 스케일 바는 50 μm을 표시합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.