سي إليغانز Blastomere تشريح: طريقة لإزالة قشر البيض والخلايا الجنينية التفكك

Overview

يقدم هذا الفيديو طريقة لعزل C. elegans blastomeres من الأجنة المبكرة.  الخلايا الناتجة هي مناسبة لثقافة الخلايا أو تجارب الجسم الحي السابق.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Hsu وآخرون ،   في المختبر إعادة تشكيل أنماط الاتصال بالخلايا المكانية مع Caenorhabditis elegans Elegans Embryo Blastomeres والخرز البوليسترين اللاصق، J. Vis. Exp. (2019).

1. عزل الجنين blastomere
2. ارتداء قفازات ومعطف المختبر لتجنب قطع والاتصال مع محلول التبييض.
   1. عقد كل طرف من الشعيرات الدموية الدقيقة (القدرة؛ 10 ميكرولتر) مع اليد اليمنى واليسارية.
   2. سحب الشعيرات الدموية الصغيرة نحو كلا الطرفين لتطبيق التوتر وجلب مركز الشعرية على الموقد لجعل اثنين من الشعيرات الدموية سحبت باليد (الشكل 1A).
   3. تقليم نصائح من الشعيرات الدموية سحبت باليد مع ملقط تحت المجهر تشريح وإرفاق الشعرية سحبت في جهاز ماصة الفم. إعداد نوعين من ماصة. وينبغي أن تكون أحجام فتح تلميح للمواسير ما يقرب من 2x و 1x طول المحور القصير من الأجنة C. elegans (30 ميكرومتر) لنقل الجنين وإزالة قشر البيض، على التوالي الشكل 1B-D).
   4. ماصة 45 ميكرولتر من محلول ملح البيض على بئر من شريحة متعددة (الشكل 2A؛ أسفل).
   5. ضع 5-10 من البالغين C. elegans على بئر يحتوي على محلول ملح البيض.
   6. للحصول على الأجنة C. elegans في وقت مبكر، وقطع البالغين إلى قطع عن طريق وضع اثنين من الإبر إلى اليمين واليسار من الجسم C. elegans وانزلاق الإبر الماضي بعضها البعض(الشكل 2A؛ المخططات العليا).
   7. ماصة 45 ميكرولتر من محلول هيبوكلوريت على بئر بجوار البئر التي تحتوي على محلول ملح البيض(الشكل 2B).
   8. ماصة 45 ميكرولتر من متوسط النمو شيلتون على الآبار الثلاثة اللاحقة بجوار البئر التي تحتوي على محلول هيبوكلوريت(الشكل 2B).
   9. نقل مرحلة خلية واحدة وأوائل 2 خلية مرحلة الأجنة في محلول هيبوكلوريت عن طريق الفم pipetting مع الشعرية مرسومة باليد لنقل الأجنة (الشكل 2B).
   10. انتظر لمدة 40-55 s.
   11. غسل الأجنة عن طريق نقل الأجنة من محلول هيبوكلوريت في المتوسط النمو شيلتون عن طريق الفم pipetting مع الشعرية مرسومة باليد لنقل الأجنة (الشكل 2B).
   12. غسل الأجنة مرة أخرى عن طريق نقل الأجنة إلى بئر جديدة من المتوسط النمو شيلتون عن طريق الفم pipetting مع الشعرية مرسومة باليد لنقل الأجنة (الشكل 2B).
   13. نقل الأجنة المغسولة إلى بئر جديدة من متوسط النمو شيلتون عن طريق الفم pipetting مع الشعيرات الدموية مرسومة باليد لنقل الأجنة. باستخدام الشعرية مرسومة باليد لإزالة قشر البيض، كرر بعناية pipetting(الشكل 2C؛التخطيطات الوسطى). إذا تمت إزالة قشر البيض بنجاح ، ستصبح الخلايا الجنينية أكثر كروية(الشكل 2C؛ الحق).
   14. فصل 2-خلية مرحلة blastomeres الجنينية بلطف وباستمرار pipetting مع الشعرية مرسومة باليد لإزالة قشر البيض (الشكل 2D).

الشكل 1: عزلة بلاستومير. (أ) سحب اليد من الزجاج الشعرية. (ب)الشعرية الزجاجية المرسومة باليد لنقل الأجنة. (ج) رسمها باليد الزجاج الشعرية لإزالة قشر البيض. (D) التخطيطات التي تبين الحجم المناسب لفتح الشعرية لإزالة قشر البيض. تشير الأسهم إلى الأجنة. تظهر أشرطة المقياس 100 ميكرومتر.

الشكل 2: سير عمل عزل Blastomere. (أ)تشريح البالغين C. elegans في البيض العازلة الملح للحصول على الأجنة. تظهر الصور أجنة من خلية و4 خلايا قبل إزالة قشر البيض. (ب) معالجة وغسيل هيبوكلوريت. (ج)التخطيطات تصور التوقيت المناسب لإزالة قشر البيض. تظهر الصورة جنينا من 4 خلايا بعد إزالة قشر البيض. (د) فصل بلاستومير. تظهر الصورة جنينا منفصلا من خلتين. أحجام الأسهم في C و D تشير إلى القوى النسبية المطلوبة أثناء pipetting. أشرطة المقياس تظهر 50 ميكرومتر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.