Irradiación UV: Un método para integrar matrices extracromosómicas

Overview

La microinjección de los transgéneros generalmente resulta en cepas de C. elegans con grandes matrices extracromosómicas, que resultan en la expresión variable y la transmisión del transgénero.  La irradiación UV puede inducir la integración cromosómica de la matriz y una transmisión transgene más estable.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Mariol et al, A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome, J. Vis. Exp. (2013).

1. Irradiación UV y recuperación de gusanos transgénicos

1. Irradiación de gusanos:
   1. Elija entre 30 y 100 animales L4 transgénicos fluorescentes en placas de cultivo separadas (15-20 animales por placa).
   2. Coloque las placas, con las tapas removidas, en un travesaño UV. Irradia los gusanos a 0,012 J/cm². Tenga en cuenta que las cepas son más o menos sensibles a los rayos UV y que los resultados pueden ser variables dependiendo del irradiador UV utilizado. Se puede analizar un intervalo de dosis entre 0,010-0,015 J/cm^2.
2. Recuperación de gusanos después de la irradiación:
   1. Coloque placas con gusanos irradiados durante la noche a 15 °C para su recuperación.
   2. Compruebe el número de animales que están vivos. En nuestras manos, una tasa de supervivencia de alrededor del 80-90% está adaptada para una irradiación eficiente.
   3. Cultivar los animales irradiados a 15-25 °C hasta que la progenie haya llegado a la etapa de desarrollo permitiendo la observación de la expresión del marcador de coinjeción.

2. Aislamiento de líneas transgénicas integradas

1. Selección de animales de F1:
   1. Animales F1 fluorescentes individuales de 150-200 en placas de cultivo separadas. Para líneas altamente transmisoras (≥80%), 100 animales de F1 son suficientes.
   2. Mantenga estas placas F1 a 15-25 °C hasta que la progenie alcance una etapa apropiada para la observación de animales fluorescentes de F2.
   3. Deseche todas las placas F1 que presenten i) ninguna progenie, lo que indica que el animal F1 era estéril o murió, o ii) no o sólo pocos animales fluorescentes de F2, lo que indica que el animal F1 no transmitió el transgénero al ritmo esperado. Este paso es rápido y representa una ventaja real en comparación con el protocolo estándar que requiere una estimación del porcentaje de gusanos F2 fluorescentes con el fin de seleccionar placas F1 que exhiben ≥75% progenie fluorescente (Tabla 1).
2. Selección de animales F2:
   1. Cuatro animales F2 transgénicos fluorescentes de cada placa F1 seleccionada. Cuando utilice transgenes fluorescentes (por ejemplo mCherry, gfp o dsRed), elija gusanos F2 con un alto nivel de fluorescencia, ya que esto podría indicar que estos animales son homocigótidos para la matriz integrada. Tenga en cuenta que al recoger animales F2 es fundamental no llevar consigo huevos o larvas, con el fin de evitar falsos negativos en el siguiente paso.
   2. Cultivar animales F2 a 15-25 °C.
3. Aislamiento y validación de cepas transgénicas integradas:
   1. Pantalla placas F2 para gusanos F3 transgénicos 100% fluorescentes. La pantalla es bastante rápida, ya que la presencia de un solo gusano nofluorescente indica que la placa debe ser arrojada. Un homocigógico animal F2 para el transgénero integrado dará progenie fluorescente 100% homocigógico.
   2. Solo ocho animales F3 fluorescentes de placas seleccionadas para confirmar la herencia del 100% del transgénero. En teoría, recoger un animal es suficiente a este paso. Sin embargo, es posible que sea necesario elegir ocho animales fluorescentes de F3 para evitar seleccionar animales pocotiles o poco saludables, ya que la irradiación puede inducir aleatoriamente mutaciones que afectan a genes importantes para la fisiología de los gusanos.
   3. Si es posible mantener varias cepas transgénicas integradas independientes, es decir, cepas recuperadas de diferentes animales de F1.

Representative Results

Tabla 1. Comparación de los protocolos estándar y mejorados para la integración de matrices extracromosomales en elgenomade C. elegans. Dos transgenes no integrados que transmitían aproximadamente a la misma frecuencia se integraron utilizando el protocolo estándar o mejorado. La principal diferencia radica en el hecho de que en el protocolo estándar se realiza una pantalla de la progenie en todas las placas F1 para estimar el porcentaje de gusanos F2 transgénicos, que deben ser ≥ 75%. Este paso lleva mucho tiempo, especialmente si la tasa inicial de transmisión es cercana al 75%. En el protocolo mejorado, basta con un solo cuatro gusanos F2 de cada placa F1 que transporta animales transgénicos de F2 y para detectar el 100% de los gusanos transgénicos en la progenie (F3), que se pueden realizar rápidamente. El protocolo estándar está adaptado.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms