Overview
וידאו זה מתאר טכניקות אופטוגנטיות על ידי הפעלת נוירונים סומטוסנסוריים מהונדסים גנטית והקלטת תגובה התנהגותית עורר עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה.
Protocol
1. הר הזחלים לניסויים התנהגותיים
- הפוך 1.5% נמוך להמיס agarose ב ddH2O ולאחסן בלוק חום 42 °C (70 °F) כדי למנוע ממנו להתגבש.
- באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את אחד הזחלים מוקרן מראש לתוך צינור של 1.5% נמוך להמיס agarose עם מעט מים כחולים / עובריים ככל האפשר.
- מעבירים זחלים בטיפת אגרוז לצלחת פטרי קטנה.
- תחת מיקרוסקופ מנתח, מקם את הגב של הזחל למעלה.
- כאשר agarose התגבש, לחתוך את agarose עם סכין גילוח דק (#11 אזמל), משאיר טריז של אגר סביב הזחל כולו.
- הפוך שני חתכים אלכסוניים משני צדי החלמון; היזהר לא לחתוך את הזחל.
- מלאו את האזור המקיף את ההתעוררות במים עובריים /כחולים.
- משוך את agarose מן הגזע והזנב של הזחל (איור 1).
2 . הכנת מצלמה ותוכנת דימות במהירות גבוהה
- הר מצלמה במהירות גבוהה על טווח ניתוח.
- חבר מצלמה למחשב.
- הפעל את המחשב.
- הפעל מצלמה במהירות גבוהה.
- פתח תוכנת וידאו/הדמיה (אנו משתמשים בתוכנת דימות AOS ונתאר נהלים לשימוש בה כאן, אך תוכנות הדמיה אחרות מקובלות באותה מידה).
- התאם את הגדרות המצלמה בהתאם (כלומר 1,000 מסגרות לשניה (fps), מאגר גורם מפעיל של 50% או הגדרות מועדפות אחרות).
- תתחיל להקליט.
3. הפעל נוירונים בודדים באמצעות לייזר 473 ננומטר
- חבר ממריץ, לייזר וכבל אופטי.
- תדליק את הממריץ.
- הגדר ממריץ למקסימום של 5 וולט ומשך דופק של 5 msec.
- הפעל לייזר בהתאם להוראות היצרן.
- השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי למקם את קצה הכבל האופטי ליד גוף התא של נוירון עם ביטוי ChEF-tdTomato (איור 1).
- לספק דופק של אור כחול כדי להפעיל נוירון חושי.
- רשום אופן פעולה באמצעות מצלמה במהירות גבוהה המוגדרת ב- 500 או 1,000 מסגרות לשניה.
- חזור על הניסוי לפי הצורך, ממתין דקה אחת בין כל הפעלה כדי למנוע הרגלה. (אנו מתעדים מינימום של שלוש תגובות עבור כל נוירון).
- כדי לשחרר זחלים, לחטט לגזרים agarose עם מלקחיים, מקפיד לא לפגוע בבעל החיים. בעל חיים זה יכול להיות מותר להתפתח עוד יותר ואת ההליך ניתן לחזור בשלב ישן יותר כדי לאפיין את התפתחות ההתנהגות. העובר יכול גם להיות נטען מחדש עבור הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של התא הפעיל כדי לתאם התנהגות עם מבנה הסלולר, כמתואר להלן.
- העבר זחלים לצלחת תרבות עם מים כחולים / עוברים טריים. אנו משתמשים בצלחת של 24 בארות כדי לעקוב אחר זחלים בודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1. תרשים של זחל זברה רכוב ותאי עצב מייצגים המעורבים בתגובת מגע הזחל. זחלי זברה הורכבו חלקית ב 1.5% נמוך להמיס agarose (מיוצג על ידי קווים מקווקווים המקיפים את החלק rostral של הזחל). נוירון טריגמינלי (בראש) ונוירון Rohon-Beard (בתא המטען) מתוארים באדום. תאי Mauthner מתוארים על ידי קווים מקווקווים בזחל. הכבל האופטי (לבן) מוצג ממוקם מעל גוף תא הנוירון RB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue | ||
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
