Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- בזחלי זברה, גירוי חזותי יכול להפעיל נוירונים סומטוסנסוריים ולהפעיל תגובת בריחה. ישנם שני סוגים של נוירונים כאלה שנמצאו בזחל, תאי עצב טריגמינליים ורוהון-בירד.
כדי לבצע טכניקה זו, הר זחל מהונדס עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה בג'ל agarose ומניחים אותו תחת מיקרוסקופ לנתח.
מקם את קצה הכבל האופטי ליד תא המטען שבו נמצא גוף התא של הנוירון Rohon-Beard. ספק דופק של אור לייזר כחול.
בפרוטוקול הדוגמה, נעלה את הזחלים כדי להפעיל את הנוירון Rohon-Beard, להביע גרסה channelrhodopsin ולבחון את התגובה ההתנהגותית.
- הפוך 1.5% נמוך להמיס agarose במים מזוקקים כפול ולאחסן בגוש חום 42 מעלות צלזיוס כדי למנוע ממנו להתגבש.
תחת מיקרוסקופ מנתח, מקם את הצד הגבי הזחל למעלה. כאשר ההתעוררות מתגבשת, השתמש בסכין גילוח דק כדי לחתוך את ההתעוררות משני צידי הזחל.
לאחר מכן, לעשות שני חתכים אלכסוניים של שני הצדדים של החלמון, נזהר לא לחתוך את הזחל. לאחר מכן, למשוך את agarose מן הגזע ואת הזנב של הזחל.
כעת התקן את המצלמה המהירה על טווח הניתוח וחבר את המצלמה למחשב. לאחר מכן הפעל את המחשב ואת המצלמה המהירה. פתח את תוכנת הדמיית הווידאו והתאם את הגדרות המצלמה.
לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הניתוח הפלואורסצנטי כדי למקם את קצה הכבל האופטי ליד גוף תא נוירון עם ביטוי ChEF-tdTomato. ספק דופק של אור כחול כדי להפעיל את הנוירון החושי.
כדי לשחרר את הזחל, לחטט לגזרים את agarose עם מלקחיים ולהיזהר לא לפגוע בחיה. ואז להעביר אותו לתוך מים עוברים כחולים טריים. בעלי החיים יכולים להיות מותר להתפתח עוד יותר, ואת ההליך ניתן לחזור בשלבים ישנים יותר. העובר יכול גם להיות remounted עבור הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של התא הפעיל על מנת לתאם את ההתנהגות עם מבנה הסלולר.
