얼룩말 광유전학: 유전적으로 변형된 소마토감각 뉴런을 활성화하여 유목 행동 반응을 연구합니다.

Overview

이 비디오는 유전자 변형 된 somatosensory 뉴런을 활성화하고 고속 비디오 카메라로 행동 반응을 유도기록하여 광유전학 적 기술을 설명합니다.

Protocol

1. 행동 실험을 위한 애벌레 산

1. ddH2O에서 1.5% 낮은 용융 아가로즈를 만들고 42°C 열 블록에 보관하여 고화되지 않도록 하십시오.
2. 유리 파스퇴 르 피펫을 사용 하 여, 1.5% 낮은 녹는 아가로즈의 튜브에 미리 선별 된 애벌레 중 하나를 가능한 한 작은 파란색 /배아 물으로 전송.
3. 아가로즈 한 방울에 새벌레를 작은 페트리 접시에 옮기다.
4. 해부 현미경에서, 배치 애벌레 등등.
5. 아가로즈가 굳어졌을 때, 얇은 면도날(#11 메스)으로 아가로즈를 잘라내어 애벌레 전체에 천의 쐐기를 남깁니다.
6. 노른자의 양쪽에 두 개의 대각선 컷을 확인; 애벌레를 닉하지 않도록주의하십시오.
7. 아가로즈 주변 지역을 배아/푸른 물로 채웁니다.
8. 애벌레의 트렁크와 꼬리에서 아가로오스를 당깁니다(그림1).

2 . 고속 카메라 및 이미징 소프트웨어 준비

1. 해부 범위에 고속 카메라를 탑재.
2. 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
3. 컴퓨터를 켭니다.
4. 고속 카메라를 켭니다.
5. 개방형 비디오/이미징 소프트웨어(AOS 이미징 소프트웨어를 사용하고 여기에서 사용하는 절차를 설명하지만 다른 이미징 소프트웨어도 똑같이 허용됩니다).
6. 카메라 설정을 그에 따라조정합니다(예: 초당 1,000프레임(fps), 트리거 버퍼 50% 또는 기타 선호하는 설정).
7. 녹음을 시작합니다.

3. 473 nm 레이저를 사용하여 단일 뉴런을 활성화

1. 자극기, 레이저 및 광학 케이블을 부착합니다.
2. 자극기 켜십시오.
3. 자극기를 최대 5볼트로 설정하고 펄스 지속 시간은 5msec입니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 레이저를 켭니다.
5. 해부 현미경을 사용하여 ChEF-tdTomato 발현(도1)을사용하여 신경체 의 세포 체내 근교에 광학 케이블의 끝을 배치한다.
6. 감각 뉴런을 활성화하기 위해 청색광의 펄스를 전달합니다.
7. 초당 500 프레임 또는 1,000 프레임으로 설정된 고속 카메라를 사용하여 동작을 기록합니다.
8. 습관화를 피하기 위해 각 활성화 사이에 1분 간 대기하여 원하는 대로 실험을 반복합니다. (각 뉴런에 대해 최소 3개의 응답을 기록합니다).
9. 애벌레를 풀어주기 위해, 동물을 다치게하지 않도록주의, 집게와 함께 아가로즈 를 캐비. 이 동물은 더 발전할 수 있고 절차는 행동의 발달을 특성화하기 위하여 이전 단계에서 반복될 수 있습니다. 배아는 또한 아래에 설명된 바와 같이, 세포 구조와 행동을 상관연관하기 위해 활성화된 세포의 고해상도 공초점 화상 진찰을 위해 재장착될 수 있다.
10. 신선한 파란색 / 배아 물로 배양 접시에 유충을 옮김. 우리는 개별 애벌레를 추적하기 위해 24 웰 접시를 사용합니다.

Representative Results

그림 1. 장착 된 제브라피시 애벌레와 애벌레 터치 반응에 관련된 대표적인 뉴런의 다이어그램. 제브라피쉬 애벌레는 부분적으로 1.5% 낮은 용융 아가로즈(애벌레의 장밋빛 부분을 둘러싼 파선으로 표현)에 부분적으로 장착되었다. 삼차 뉴런 (머리에) 및 로한 수염 뉴런 (트렁크)은 빨간색으로 묘사됩니다. Mauthner 세포는 애벌레에 있는 점선에 의해 설명됩니다. 광학 케이블(white)은 RB 뉴런 세포 체내에 위치되어 있는 것으로 나타났다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melt agarose	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100x15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent