Overview
Это видео описывает оптогенетические методы, активируя генетически модифицированные соматосензорные нейроны и записывая полученную поведенческую реакцию с помощью высокоскоростной видеокамеры.
Protocol
1. Гора Личинки для экспериментов поведения
- Сделайте 1,5% низкорастучей агарозы в ddH2O и храните в тепловом блоке 42 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить его затвердевение.
- Используя стеклянную пипетку Pasteur, перенесите одну из предварительно экранированных личинок в трубку с 1,5% низкой талой агарозой с как можно меньшей голубой/эмбриональной водой.
- Перенесите личинки в каплю агарозы на небольшую чашку Петри.
- Под рассеченным микроскопом положение личинки спинной вверх.
- Когда агароза затвердела, отрежьте агарозу тонким лезвием бритвы (#11 скальпелем), оставив клин агара вокруг всей личинки.
- Сделайте два диагональных разреза по обе стороны от желтка; заботиться, чтобы не ник личинки.
- Заполните область, окружающую агарозу, эмбрионом/голубой водой.
- Вытяните агарозу от ствола и хвоста личинки(рисунок 1).
2 . Подготовка высокоскоростной камеры и программного обеспечения для визуализации
- Установить высокоскоростную камеру на вскрытии области.
- Подключите камеру к компьютеру.
- Включите компьютер.
- Включите высокоскоростную камеру.
- Открытое программное обеспечение для видео/изображений (мы используем программное обеспечение для визуализации AOS и опишем процедуры его использования здесь, но другое программное обеспечение для визуализации одинаково приемлемо).
- Отрегулируйте настройки камеры соответственно(т.е. 1000 кадров в секунду (fps), 50% триггер буфера или других предпочтительных настроек).
- Начните запись.
3. Активировать одиночные нейроны используя лазер 473 nm
- Прикрепите стимулятор, лазерный и оптический кабель.
- Включите стимулятор.
- Установите стимулятор максимум до 5 вольт и продолжительность импульса 5 мсек.
- Включите лазер в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте рассечение микроскопа, чтобы распоить кончик оптического кабеля вблизи клеточного тела нейрона с выражением ChEF-tdTomato(рисунок 1).
- Доставка импульса синего света для активации сенсорного нейрона.
- Запись поведения с помощью высокоскоростной камеры, установленная на уровне 500 или 1000 кадров в секунду.
- Повторите эксперимент по желанию, ожидая 1 мин между каждой активацией, чтобы избежать привыкания. (Мы записываем как минимум три ответа на каждый нейрон).
- Чтобы освободить личинок, разохлайте агарозу типсами, заботясь о том, чтобы не травмировать животное. Это животное может быть разрешено развиваться дальше и процедура может быть повторена на более старой стадии, чтобы охарактеризовать развитие поведения. Эмбрион также может быть перемонтирован для конфокальной визуализации активированной клетки с высоким разрешением, чтобы соотнести поведение с клеточной структурой, как описано ниже.
- Передача личинки в культурную тарелку со свежей голубой/эмбриональной водой. Мы используем пластину из 24 колодец для отслеживания отдельных личинок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1. Диаграмма смонтированных личинок зебры и репрезентативных нейронов, участвующих в личиночковой сенсорной реакции. Личинки зебры были частично смонтированы в 1,5% низкорастучую агарозу (представленную разбитыми линиями, окружающими рострльную часть личинки). Тригеминальный нейрон (в голове) и нейрон Рохон-Борода (в стволе) изображены красным цветом. Клетки Маутнера очерчены пунктирной линией в личинке. Оптический кабель (белый) показан расположенным над телом клетки нейрона RB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue | ||
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
