Зебрафиш Оптогенетика: Активация генетически модифицированных соматосензорных нейронов для изучения личиночные поведенческие реакции

- У личинок зебры визуальный стимул может активировать соматосензорные нейроны и вызвать реакцию на побег. Есть два типа таких нейронов, найденных в личинках, тригеминальных и рохон-борода нейронов. Мы можем манипулировать активностью этих нейронов, изменяя их, чтобы выразить трансгенные светочувствительные ионные каналы. Этот подход называется оптогенетика.

Для выполнения этой техники, смонтировать трансгенную личинку с спинной стороны лицом вверх в агарозный гель и поместить его под рассечение микроскопа. Используйте лезвие бритвы, чтобы отделить клиновидные части агарозы со всего желтка и хвоста.

Располагайте кончик оптического кабеля возле ствола, где расположено клеточное тело нейрона Рохон-Борода. Доставь пульс синего лазерного света. При воздействии синего света трансгенные светочувствительные ионные каналы в мембране нейрона открываются, позволяя ионам входить, вызывая потенциал действия, который вызывает реакцию побега.

В примере протокола, мы будем монтировать личинки, чтобы активировать нейрон Рохон-Борода, выражая вариант channelrhodopsin и наблюдать поведенческую реакцию.

- Сделать 1,5% низким содержанием расплава агарозы в двойной дистиллированной воды и хранить в 42 градусов по Цельсию тепловой блок, чтобы предотвратить его от затвердевания. Использование стекла Пастер пипетки, передача одного из предварительноэкранных личинок в трубку 1,5% низкорастучей агарозы с как можно меньше голубой воды эмбриона, как это возможно.

Под рассечением микроскопа, положение личинки спинной стороны вверх. Когда агароза затвердевает, используйте тонкое лезвие бритвы, чтобы отрезать агарозу с обеих сторон личинки.

Далее сделайте два диагональных разреза с обеих сторон желтка, будьте осторожны, чтобы не ник личинки. После этого, вытащить агарозу от ствола и хвост личинки.

Теперь установите высокоскоростную камеру на область вскрытия и подключите камеру к компьютеру. Затем включите компьютер и высокоскоростную камеру. Откройте программное обеспечение для видеосъемки и отрегулируйте настройки камеры. Далее подключите оптический кабель, лазер и стимулятор вместе. Затем включите стимулятор и установите его максимум на 5 вольт и импульс продолжительностью 5 миллисекунд.

Далее используйте флуоресцентный рассечение микроскопа, чтобы распоставить кончик оптического кабеля рядом с телом нейронной клетки с выражением ChEF-tdTomato. Доставь пульс синего света, чтобы активировать сенсорный нейрон. Затем запиши ответы с помощью высокоскоростной камеры, установленной на 500 или 1000 кадров в секунду и повторите эксперименты с по крайней мере 1 минутой между активациями, чтобы избежать привыкания.

Чтобы освободить личинку, разъединится агароза с типсами и будьте осторожны, чтобы не повредить животное. Затем перенесите его в свежую голубую эмбриона воды. животные могут быть разрешены для дальнейшего развития, и процедура может быть повторена на более ранних стадиях. Эмбрион также может быть перемонтирован для конфокальной визуализации активированной клетки для того, чтобы соотнести поведение с клеточной структурой.