Zebrafisk Optogenetics: Aktivering genetisk modificeret Somatosensory Neuron at studere larve adfærdsmæssige reaktioner

- I zebrafisklarver kan en visuel stimulus aktivere somatosensoriske neuroner og udløse en flugtrespons. Der findes to typer af sådanne neuroner i larven, trigeminus- og Rohon-Beard-neuroner. Vi kan manipulere aktiviteten af disse neuroner ved at ændre dem for at udtrykke transgene lysfølsomme ionkanaler.

For at udføre denne teknik skal du montere en transgen larve med rygsiden vendt op i agarosegel og placere den under et dissekerende mikroskop. Brug et barberblad til at løsne en kileformet del af agarose fra omkring æggeblommen og halen.

Placer spidsen af et optisk kabel nær bagagerummet, hvor Rohon-Beard neuronens cellekrop er placeret. Lever en puls af blåt laserlys. Ved udsættelse for det blå lys åbner de transgene lysfølsomme ionkanaler i neuronens membran, så ioner kan komme ind, hvilket udløser et handlingspotentiale, der fremkalder flugtresponset.

I eksempelprotokollen monterer vi larverne for at aktivere Rohon-Beard neuron, udtrykke en channelrhodopsin-variant og observere adfærdsresponset.

- Lav 1,5% lavt smeltende agarose i dobbeltdestilleret vand og opbevar i en 42 grader Celsius varmeblok for at forhindre det i at størkne. Ved hjælp af et glas Pasteur pipette overføres en af forskærmslarverne til et rør på 1,5% lavt smeltende agarose med så lidt blåt embryovand som muligt.

Under et dissekerende mikroskop skal larvens dorsale side op. Når agarose er størknet, skal du bruge et tyndt barberblad til at skære agarose væk fra begge sider af larven. Fyld området omkring agarose med embryoblåt vand.

Dernæst gør to diagonale udskæringer af begge sider af æggeblommen, pas på ikke at nick larven. Bagefter trække agarose væk fra bagagerummet og halen af larven.

Monter nu højhastighedskameraet på dissekeringsområdet og tilslut kameraet til computeren. Tænd derefter computeren og højhastighedskameraet. Åbn videobilledsoftwaren og juster kameraindstillingerne. Næste, tilslut optisk kabel, laser og stimulatoren sammen. Tænd derefter stimulatoren og sæt den til maksimalt 5 volt og en pulsvarighed på 5 millisekunder efterfølgende, tænd for laseren.

Brug derefter det fluorescerende dissekerende mikroskop til at placere spidsen af det optiske kabel i nærheden af en neuroncellekrop med ChEF-tdTomato-udtryk.

For at frigive larven skal du lirke agarosen fra hinanden med pincet og passe på ikke at skade dyret.