Zebravis optogenetica: het activeren van genetisch gemodificeerd somatosensorisch neuron om larvale gedragsreacties te bestuderen

- Bij zebravislarven kan een visuele stimulus somatosensorische neuronen activeren en een ontsnappingsreactie activeren. Er zijn twee soorten van dergelijke neuronen te vinden in de larve, trigeminus- en Rohon-Beard-neuronen. We kunnen de activiteit van deze neuronen manipuleren door ze aan te passen om transgene lichtgevoelige ionenkanalen uit te drukken. Deze benadering wordt optogenetica genoemd.

Om deze techniek uit te voeren, monteert u een transgene larve met de dorsale kant naar boven gericht in agarosegel en plaatst u deze onder een ontledende microscoop. Gebruik een scheermesje om een wigvormig deel van de agarose los te maken van rond de dooier en staart. Vul dit gebied met eiwater. Trek de agarose weg van de stam en staart van de larve.

Plaats de punt van een optische kabel in de buurt van de stam waar het cellichaam van het Rohon-Beard neuron zich bevindt. Lever een puls van blauw laserlicht. Bij blootstelling aan het blauwe licht openen de transgene lichtgevoelige ionen in het membraan van het neuron, waardoor ionen kunnen binnendringen, waardoor een actiepotentiaal wordt geactiveerd dat de ontsnappingsreactie oproept. Registreer het gedrag van de larve met behulp van een hogesnelheidscamera.

In het voorbeeldprotocol zullen we de larven monteren om het Rohon-Beard-neuron te activeren, een channelrhodopsine-variant uit te drukken en de gedragsrespons te observeren.

- Maak 1,5% laagsmeltende agarose in dubbel gedestilleerd water en bewaar in een hitteblok van 42 graden Celsius om te voorkomen dat het stolt. Breng met behulp van een glazen Pasteur pipet een van de voorscreenlarven over in een buis van 1,5% laagsmeltende agarose met zo min mogelijk blauw embryowater. Breng de larve vervolgens in een druppel agarose over op een kleine Petrischaal.

Plaats onder een ontledende microscoop de dorsale kant van de larve naar boven. Wanneer de agarose gestold is, gebruik dan een dun scheermesje om agarose aan beide zijden van de larve weg te snijden. Vul het gebied rond de agarose met embryoblauw water.

Maak vervolgens twee diagonale sneden aan beide zijden van de dooier, waarbij u oppast om de larve niet te stelen. Trek daarna de agarose weg van de stam en de staart van de larve.

Monteer nu de high-speed camera op de ontledingsomvang en sluit de camera aan op de computer. Schakel vervolgens de computer en de high-speed camera in. Open de videobeeldsoftware en pas de camera-instellingen aan. Sluit vervolgens de optische kabel, de laser en de stimulator met elkaar aan. Schakel vervolgens de stimulator in en stel deze in op maximaal 5 volt en een pulsduur van 5 milliseconden. Schakel vervolgens de laser in.

Gebruik vervolgens de fluorescerende ontledingsmicroscoop om de punt van de optische kabel in de buurt van een neuroncellichaam te plaatsen met ChEF-tdTomato-expressie. Lever een puls blauw licht om het sensorische neuron te activeren. Noteer vervolgens de reacties met een hogesnelheidscamera die is ingesteld op 500 of 1.000 frames per seconde en herhaal de experimenten met ten minste 1 minuut tussen activeringen om gewennerij te voorkomen.

Om de larve los te laten, wringt u de agarose uit elkaar met een tang en moet u ervoor zorgen dat het dier niet gewond wordt. Breng het vervolgens over in vers blauw embryowater. De dieren kunnen zich verder ontwikkelen en de procedure kan in oudere stadia worden herhaald. Het embryo kan ook opnieuw worden gemonteerd voor confocale beeldvorming met hoge resolutie van de geactiveerde cel om het gedrag te correleren met de cellulaire structuur.