Optogétique du poisson zèbre : Activation du neurone somatosensory génétiquement modifié pour étudier les réponses comportementales larvaires

- Chez les larves de poisson zèbre, un stimulus visuel peut activer les neurones somatosensoriels et déclencher une réponse d’évasion. Il existe deux types de ces neurones trouvés dans les neurones larve, trigeminal et rohon-barbe. Nous pouvons manipuler l’activité de ces neurones en les modifiant pour exprimer des canaux iions transgéniques sensibles à la lumière. Cette approche est appelée optogénétique.

Pour effectuer cette technique, montez une larve transgénique avec le côté dorsal orienté vers le haut dans le gel d’agarose et placez-la sous un microscope disséquant. Utilisez une lame de rasoir pour détacher une partie en forme de coin de l’agarose autour du jaune et de la queue. Remplissez cette zone avec de l’eau d’oeuf. Tirez l’agarose loin du tronc et de la queue de la larve.

Placez la pointe d’un câble optique près du tronc où se trouve le corps cellulaire du neurone Rohon-Beard. Livrer une impulsion de lumière laser bleue. Lors de l’exposition à la lumière bleue, les canaux iions transgéniques sensibles à la lumière dans la membrane du neurone s’ouvrent, permettant aux ions d’entrer, déclenchant un potentiel d’action qui provoque la réponse à l’évasion. Enregistrez le comportement de la larve à l’aide d’une caméra à grande vitesse.

Dans le protocole d’exemple, nous monterons les larves pour activer le neurone rohon-barbe, exprimant une variante de channelrhodopsin et observons la réponse comportementale.

- Faire 1,5% d’agarose à faible fond dans de l’eau double-distillée et les conserver dans un bloc thermique de 42 degrés Celsius pour l’empêcher de se solidifier. À l’aide d’une pipette pasteur en verre, transférer l’une des larves pré-écran dans un tube de 1,5% d’agarose à faible fond avec le moins d’eau embryonnaire bleue possible. Puis transférer la larve dans une goutte d’agarose sur une petite boîte de Pétri.

Sous un microscope disséquant, placez le côté dorsal de larve vers le haut. Lorsque l’agarose est solidifiée, utilisez une fine lame de rasoir pour couper l’agarose des deux côtés de la larve. Remplissez la zone entourant l’agarose avec de l’eau bleue embryonnaire.

Ensuite, faire deux coupes diagonales des deux côtés du jaune, en prenant soin de ne pas entailler la larve. Ensuite, tirez l’agarose loin du tronc et la queue de la larve.

Montez maintenant la caméra à grande vitesse sur la portée de dissecting et connectez la caméra à l’ordinateur. Allumez ensuite l’ordinateur et la caméra à grande vitesse. Ouvrez le logiciel d’imagerie vidéo et ajustez les paramètres de la caméra. Ensuite, connectez le câble optique, le laser et le stimulateur ensemble. Allumez ensuite le stimulateur et réglez-le à un maximum de 5 volts et à une durée d’impulsion de 5 millisecondes. Par la suite, allumez le laser.

Ensuite, utilisez le microscope à disséquer fluorescent pour positionner la pointe du câble optique près d’un corps de cellule neuronale avec l’expression ChEF-tdTomato. Livrer une impulsion de lumière bleue pour activer le neurone sensoriel. Puis enregistrer les réponses à l’aide d’une caméra à grande vitesse fixée à 500 ou 1000 images par seconde et répéter les expériences avec au moins 1 minute entre les activations pour éviter l’accoutumance.

Pour libérer la larve, séparer l’agarose avec des forceps et faire attention à ne pas blesser l’animal. Puis le transférer dans de l’eau d’embryon bleu frais. Les animaux peuvent être autorisés à se développer davantage, et la procédure peut être répétée à des stades plus anciens. L’embryon pourrait également être remonté pour l’imagerie confocale à haute résolution de la cellule activée afin de corréler le comportement avec la structure cellulaire.