Zebrafish Optogenetik: Aktivierung von genetisch verändertem Somatosensorischen Neuron zur Untersuchung von Larval Behavioral Responses

- Bei Zebrafischlarven kann ein visueller Stimulus somatosensorische Neuronen aktivieren und eine Fluchtreaktion auslösen. Es gibt zwei Arten solcher Neuronen, die in den Larven, Trigeminus- und Rohon-Bart-Neuronen zu finden sind. Wir können die Aktivität dieser Neuronen manipulieren, indem wir sie modifizieren, um transgene lichtempfindliche Ionenkanäle auszudrücken.

Um diese Technik durchzuführen, montieren Sie eine transgene Larve mit der dorsalen Seite nach oben in Agarose-Gel und legen Sie sie unter ein Sezieren Mikroskop. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um einen keilförmigen Teil der Agarose aus der Nähe des Dotters und Schwanzes zu lösen. Füllen Sie diesen Bereich mit Eiwasser. Ziehen Sie die Agarose weg vom Rumpf und Schwanz der Larve.

Positionieren Sie die Spitze eines optischen Kabels in der Nähe des Rumpfes, wo sich der Zellkörper des Rohon-Beard-Neurons befindet. Liefern Sie einen Puls von blauem Laserlicht. Bei Exposition gegenüber dem blauen Licht öffnen sich die transgenen lichtempfindlichen Ionenkanäle in der Membran des Neurons, so dass Ionen eindringen können, was ein Aktionspotenzial auslöst, das die Fluchtreaktion auslöst. Zeichnen Sie das Verhalten der Larve mit einer Hochgeschwindigkeitskamera auf.

Im Beispielprotokoll werden wir die Larven montieren, um das Rohon-Beard-Neuron zu aktivieren, eine Kanalrhodopsin-Variante auszudrücken und die Verhaltensreaktion zu beobachten.

- 1,5% niedrigschmelzende Agarose in doppelt destilliertem Wasser herstellen und in einem 42 Grad Celsius Wärmeblock speichern, um eine Erstarrung zu verhindern. Mit einer glasigen Pasteur-Pipette eine der Vorbildschirmlarven in ein Rohr mit 1,5% leschmelzender Agarose mit möglichst wenig blauem Embryowasser übertragen.

Positionieren Sie die Larve unter einem Sezierendes Mikroskop nach oben. Wenn die Agarose erstarrt ist, schneiden Sie Agarose von beiden Seiten der Larve mit einer dünnen Rasierklinge weg. Füllen Sie den Bereich um die Agarose mit embryoblauem Wasser.

Als nächstes machen Sie zwei diagonale Schnitte von beiden Seiten des Dotters, wobei Sie darauf achten, die Larve nicht zu nicken. Ziehen Sie anschließend die Agarose vom Stamm und dem Schwanz der Larve weg.

Befestigen Sie nun die Hochgeschwindigkeitskamera an den Sezierendes Scope und schließen Sie die Kamera an den Computer an. Schalten Sie dann den Computer und die Hochgeschwindigkeitskamera ein. Öffnen Sie die Video-Imaging-Software und passen Sie die Kameraeinstellungen an. Als nächstes verbinden Sie das Optische Kabel, den Laser und den Stimulator miteinander. Schalten Sie dann den Stimulator ein und stellen Sie ihn auf maximal 5 Volt und eine Pulsdauer von 5 Millisekunden ein. Anschließend schalten Sie den Laser ein.

Als nächstes verwenden Sie das fluoreszierende Sezieren mikroskop, um die Spitze des optischen Kabels in der Nähe eines Neuronenzellkörpers mit ChEF-tdTomato-Expression zu positionieren. Liefern Sie einen Puls von blauem Licht, um das sensorische Neuron zu aktivieren. Dann nehmen Sie die Antworten mit einer Hochgeschwindigkeitskamera auf 500 oder 1.000 Bilder pro Sekunde auf und wiederholen Sie die Experimente mit mindestens 1 Minute zwischen den Aktivierungen, um Gewöhnung zu vermeiden.

Um die Larve freizusetzen, hebeln Sie die Agarose mit Dereinzange auseinander und achten Sie darauf, das Tier nicht zu verletzen. Dann übertragen Sie es in frisches blaues Embryowasser. Die Tiere können sich weiterentwickeln, und das Verfahren kann in älteren Stadien wiederholt werden. Der Embryo könnte auch für eine hochauflösende konfokale Bildgebung der aktivierten Zelle wieder montiert werden, um das Verhalten mit der Zellstruktur zu korrelieren.