Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- I zebrafisk larver kan en visuell stimulans aktivera somatosensoriska nervceller och utlösa ett flyktsvar. Det finns två typer av sådana nervceller som finns i larven, trigeminal och Rohon-Beard nervceller.
För att utföra denna teknik, montera en transgen larva med den dorsala sidan vänd uppåt i agarose gel och placera den under ett dissekerande mikroskop. Använd ett rakblad för att lossa en kilformad del av agarosa från runt äggulan och svansen.
Placera spetsen på en optisk kabel nära bagageutrymmet där cellkroppen på Rohon-Beard-neuronen är placerad.
I exempelprotokollet kommer vi att montera larverna för att aktivera Rohon-Beard-neuron, uttrycka en channelrhodopsin-variant och observera beteendesvaret.
- Gör 1,5% lågsmält agarosa i dubbeldestillerat vatten och förvara i ett 42 grader Celsius värmeblock för att förhindra att det stelna.
Placera larvens dorsala sida uppåt under ett dissekerande mikroskop.
Därefter gör du två diagonala snitt på båda sidor av äggulan, var försiktig så att du inte hackar larven. Efteråt drar du agarosen bort från stammen och larvens svans.
Montera nu höghastighetskameran på dissekeringsomfånget och anslut kameran till datorn. Slå sedan på datorn och höghastighetskameran. Öppna videoavbildningsprogramvaran och justera kamerainställningarna.
Använd sedan det fluorescerande dissekerande mikroskopet för att placera spetsen på den optiska kabeln nära en neuroncellkropp med ChEF-tdTomato-uttryck. Leverera en puls av blått ljus för att aktivera den sensoriska neuron. Registrera sedan svaren med hjälp av en höghastighetskamera inställd på 500 eller 1 000 bilder per sekund och upprepa experimenten med minst 1 minut mellan aktiveringarna för att undvika habituation.
För att frigöra larven, bänd isär agarosen med tång och var försiktig så att du inte skadar djuret. Överför det sedan till färskt blått embryovatten. Djuren kan tillåtas utvecklas ytterligare, och proceduren kan upprepas i äldre stadier. Embryot kan också återmonteras för högupplöst konfokal avbildning av den aktiverade cellen för att korrelera beteendet med cellstruktur.
