Overview
Deze video beschrijft een methode voor het genereren van een orgaangeconditioneerd medium afgeleid van de muizenlever. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om orgaan-afgeleide oplosbare factoren en hun effecten op het orgaantropisme en gemetastaseerd gedrag van kankercellen te identificeren en te bestuderen.
Protocol
1. Generatie van long- en hersengeconditioneerde media
- In een steriele weefselkweekkap, pbs-buizen met long of hersenen drie keer omkeren om restbloed uit organen te verwijderen en PBS met bloed te aspireren. Herhaal dit met verse koude PBS totdat de oplossing helder lijkt zonder bewijs van bloed.
- Plaats longen en hersenen in aparte 60 mm2 glazen petrischalen. Met behulp van twee steriele scalpelbladen, gehakt longen of hersenen door herhaaldelijk heen en weer te snijden totdat weefselfragmenten ongeveer ~ 1 mm3 groot zijn.
- Bepaal de hoeveelheid media die nodig is om weefselfragmenten te resuspenden van het berekende gewichtsverschil.
OPMERKING: Long- en hersenweefsel worden genormaliseerd door resuspensie in een 4:1 media:weefselverhouding (vol/wt). - Resuspend weefselfragmenten in het juiste volume (eerder bepaald in stap 1.3) van Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM):F12 media aangevuld met 1x geconcentreerd mitogen supplement en penicilline (50 μg/ml)/streptomycine (50 μg/ml).
- Voeg geresuspendeerde long- of hersenweefselfragmenten toe aan één put van een 6-putplaat.
- Incubeer weefselfragmenten in media gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Verzamel na incubatie geconditioneerde media voor elk weefsel en verdun verder door drie equivalente hoeveelheden verse media toe te voegen in een conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1.000 x g in verdunde geconditioneerde media voor elk orgaan bij 4 °C om groot weefselresten te verwijderen. Verzamel mediasupernatant en filtreer door een spuitfilter van 0,22 μm.
- Pool geconditioneerde media van elk orgaan(d.w.z.long met long en hersenen met hersenen) van meerdere muizen om rekening te houden met de variabiliteit tussen muizen. Aliquot en bewaar geconditioneerde media bij -80 °C tot gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
