Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Bepaalde organen produceren oplosbare factoren en worden voorkeursplaatsen voor borstkankermetastasen. Een geconditioneerd medium bereid uit deze geoogste organen cellen kan helpen bij het identificeren en bestuderen van dergelijke factoren.
Begin met het plaatsen van een geoogst orgaan zoals een lever in een buis met koude PBS en draai de buis op en neer om het resterende bloed van het orgaan te verwijderen. Plaats het orgel in een petrischaaltje. En met behulp van een scalpel snijdt u het orgaan in kleine stukjes.
Resuspend deze stukken in een buis met een basaal medium aangevuld met een antibioticum om de celgroei te ondersteunen en besmetting te voorkomen. Giet nu de celsuspensie in een kweekplaat en incubeer bij 37 graden Celsius met een continue koolstofdioxidetoevoer voor de vereiste duur.
Tijdens de incubatie geven deze cellen metabolieten, groeifactoren, extracellulaire matrixeiwitten af in het medium. Breng vervolgens de celsuspensie over naar een centrifugebuis en voeg vers medium toe om het te verdunnen. Centrifugeer de buis en filtreer het supernatant, het geconditioneerde medium, in een verse buis.
In het volgende protocol zullen we geconditioneerde media uit de muislongen en hersenen voorbereiden om het gemetastaseerde gedrag van borstkankercellen te bestuderen.
Om het geconditioneerde medium van de long te genereren, keert u de buizen van longweefsel drie keer om om eventueel restbloed uit de organen te verwijderen. Vervang vervolgens de was door verse koude PBS en herhaal dit totdat de zoutoplossing bloedvrij is.
Breng vervolgens de longen over in één 60 vierkante millimeter glazen petrischaal per muis en gebruik twee steriele scalpelbladen om de weefsels te gehakt met herhaaldelijk heen en weer snijden.
Wanneer de weefselfragmenten ongeveer 1 millimeter in blokjes zijn, resuspend de stukken in het juiste volume DMEM/F-12 medium aangevuld met antibiotica en incubeer de weefsels in één put van een 6-put plaat per muis bij 37 graden Celsius en 5% CO2.
Breng na 24 uur de volledige inhoud van elke put over in afzonderlijke 50 milliliter conische buizen en verdun de geconditioneerde media met drie equivalente hoeveelheden verse DMEM/F-12 medium per buis.
Centrifugeer de buizen om grote stukken weefselresten te verwijderen. Pool vervolgens de geconditioneerde media door een spuitzeef van 0,22 micron in een enkele conische buis van 50 milliliter.
