Overview
Denne video beskriver en metode til at generere et organ konditioneret medium afledt af museleveren. Dette modelsystem kan bruges til at identificere og studere organ-afledte opløselige faktorer og deres virkninger på organtropisme og metastatisk adfærd kræftceller.
Protocol
1. Generation af lunge- og hjernebetingede medier
- I en steril vævskultur hætte, invertere PBS rør, der indeholder lunge eller hjerne tre gange for at fjerne resterende blod fra organer og indsugning PBS indeholder blod. Gentag med frisk kold PBS, indtil opløsningen fremstår klar uden tegn på blod.
- Placer lunger og hjerner i separate 60 mm2 glas petriskåle. Ved hjælp af to sterile skalpelblade, hakkekød lunger eller hjerner ved gentagne gange udskæring frem og tilbage, indtil væv fragmenter er ca ~ 1 mm3 i størrelse.
- Bestem mængden af medier, der er nødvendige for at genbruge vævsfragmenter fra den beregnede vægtforskel.
BEMÆRK: Lunge-og hjernevæv er vægt normaliseret ved resuspension i en 4:1 medier:væv ratio (vol / wt). - Genopstå vævsfragmenter i passende volumen (tidligere bestemt i trin 1.3) i Dulbeccos Modificerede Ørnemedium (DMEM):F12-medier suppleret med 1x koncentreret mitogentilskud og penicillin (50 μg/ml)/streptomycin (50 μg/ml).
- Tilsæt genopbrugte lunge- eller hjernevævsfragmenter til en brønd af en 6-brønds plade.
- Inkuber vævsfragmenter i medier i 24 timer ved 37 °C og 5% CO2. Efter inkubation opsamles konditionerede medier for hvert væv og fortyndes yderligere ved at tilsætte tre tilsvarende mængder friske medier i et 50 ml konisk rør.
- Centrifuge ved 1.000 x g i fortyndet konditioneret medie for hvert organ ved 4 °C i 15 minutter for at fjerne store vævsrester. Media supernatant opsamles, og der filtreres gennem et 0,22 μm sprøjtefilter.
- Pool konditioneret medier fra hvert organ(dvs.lunge med lunge og hjerne med hjerne) fra flere mus til at tage højde for mus-til-mus variation. Aliquot og opbevar konditionerede medier ved -80 °C, indtil de bruges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
