ייצור של מיקרו-רקמות באמצעות מודולים של קולגן ג'ל התאים המכילים

Summary

יצירה של מיקרו רקמות באמצעות ג'ל קולגן גלילי, המכונה מודולים, המכילות תאים אשר מוטבעים משטח מצופה בתאי האנדותל.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את ייצור של סוג של מיקרו הרקמות נקרא מודולים. הגישה מודול מחולל אחיד, רקמות מדרגי vascularized. המודולים יכולים להיות עשויים קולגן כמו גם חומרים gelable או crosslinkable אחרים. הם כ -2 מ"מ אורך ו 0.7 מ"מ קוטר על ייצור אבל לכווץ בגודל עם תאים מוטבע או כאשר המודולים הם מצופים בתאי האנדותל. מודולים בנפרד הם קטנים מספיק שתאי המוטבע בתוך מגבלת דיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים אחרים, אבל מודולים יכול להיות ארוזים יחד כדי ליצור רקמות גדול כי הם perfusable. רקמות אלה מודולרי בבנייה כי תאים מסוגים שונים יכול להיות מוטבע או מצופה על מודולים לפני שהם ארוזים יחד כדי ליצור רקמות מורכבות. ישנם שלושה שלבים עיקריים שהופך את המודולים: (1) לנטרל את הקולגן הטבעה תאים זה, (2) gelling קולגן בצינור חיתוך מודולים ו (3) ציפוי מודולים עם לתאי אנדותל.

Protocol

1) הכנת Tubing

1. חותכים 2-3 מ 'אורך של צינורות פוליאתילן (0.76 מזהה מ"מ x 1.22 מ"מ OD).
2. נושא מחט 20 G1 לתוך קצה אחד של הצינור.
3. בצינור קויל מקום בנרתיק הממירים עצמית חותם (7 1 / 2 "x 13"). שני הקצוות של הצינור צריך להיות ממוקם בסוף unsealed של התיק והדביקה במקום עם הקלטת עיקור גז.
4. תיק חותם וגז לעקר.

2) נטרול של קולגן

הערה: 1 מ"ל של הקולגן ממלא בערך 2 מ 'של צינורות פוליאתילן.

1. מניחים את הסכום הדרוש של קולגן הדרושים באורך הרצוי של צינור לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ולשמור על הקרח.
2. הוספת 128 UL של 10x α-ממ לכל מ"ל של קולגן על הצינור ומערבבים שוב ושוב על ידי pipetting את הפתרון. הערה: (1) הפתרון צריך להפוך צהוב כמו α-ממ מעורבב לתוך הקולגן acidified ו (2) מנסים למזער בועות כאשר ערבוב.
3. לנטרל את הקולגן ידי הוספת 0.8 סודיום ביקרבונט M עד הקולגן יש pH של 7.4. להערכה הכללית של נתרן ביקרבונט להוסיף pH עד הפתרון קולגן הצהוב הופך צבע ורוד בהיר. הערה: בדרך כלל לוקח 30-60 μL לכל מ"ל כל אחד קולגן.
4. שמור קולגן מנוטרל על הקרח עד מוכן לשימוש כמו קולגן מנוטרל יהיה ג'ל אם לא שמר על 4 ° C.

3) הטבעת של תאים (אופציונלי)

הערה: בהתאם לסוג התא תאים יכול להיות מוטבע בריכוז של בין 1 מיליון תאים לכל מ"ל עד 20 מיליון תאים לכל מ"ל. השתמש בינוני נדרש התאים שברצונך להטביע.

1. הסר מדיה מתאי ולשטוף עם 5 מ"ל PBS.
2. הסר PBS ולהוסיף 3 מ"ל טריפסין-EDTA.
3. דגירה התאים טריפסין-EDTA במשך 5 דקות ב 37 ° C.
4. Resuspend תאים 7 מדיה מ"ל.
5. ספירת תאים.
6. העברת את המספר הדרוש של תאים להטבעת אל צינור חרוטי 15 מ"ל.
7. גלולה התאים XG ב 300 דקות 5.
8. לשאוב את התקשורת גלולה התא.
9. Resuspend התאים הקולגן לנטרל ולשמור על הקרח.

4) gelling של קולגן

1. בארון בטיחות ביולוגית לחתוך את הקצה האטום של שקית המכילה את צינורות פוליאתילן.
2. צרף מזרק 3 מ"ל עד 20 גרם של המחט בקצה אחד של צינורות בעזרת פינצטה מעוקרים. שמור את צינורות בתיק.
3. הכנס את הקצה השני של הצינור לתוך הקולגן לנטרל עד קצה הוא בחלק התחתון של צינור חרוטי באמצעות פינצטה מעוקרים. שמור את צינור חרוטי על הקרח.
4. משוך את הקולגן לתוך צינורות פוליאתילן ידי retracting על הבוכנה של המזרק באיטיות.
   הערה: אם קולגן הוא נכנס בצינור במהירות ואז יהיה בועות הטופס הקולגן.
5. לאחר משיכת קולגן באמצעות צינורות, למשוך את המחט 20 גרם מתוך צינורות ולשים בשני הקצוות בחזרה לשקית. את השקית Tape עצומות.
6. דגירה את התיק על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. אם קולגן מכילה תאים ואז להעיף את התיק מעל 15 דקות מדי. כך התאים אינם להשתקע לצד אחד של המודול.

5) חיתוך של Tubing מכיל קולגן בג'ל

1. כותרות החיטוי ואת להב עבור המכשיר חיתוך מגש להחזיק בצינור.
2. להרכיב את מכשיר חיתוך.
3. צינורות מקום מגש סטרילי מול חיתוך המכשיר לטעון את צינורות לתוך מכשיר החיתוך.
4. הגדרת צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של התקשורת בנקודת היציאה של המכשיר חיתוך לאסוף את המודולים לחתוך.
   הערה: המדיה המכילה השתמש FBS אפילו בלבד קולגן מודולים כמו המודולים לא נפרד מן צינורות ללא FBS בתקשורת. אם המודולים מכילים תאים להשתמש בתקשורת נדרש התאים מוטבע. אם אין תאים מוטבע המודולים להשתמש בתקשורת עבור לתאי אנדותל.
5. הגדר את מכשיר חיתוך לחתוך 2 מ"מ של צינורות באורכים וחתך את הצינור.
6. דגירה לחתוך מודולים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות בצינור חרוטי 50 מ"ל.

6) הסרת מודולים קולגן מ - Tubing

1. וורטקס צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל מודולים צינורות במשך 10 שניות.
   הערה: כאשר עדין המפריד מודולים מוטבע עם צפיפות התאים גבוהה כדי למנוע שבירה.
2. בואו מודולים ליישב לתחתית של התחתית. לוקח בערך 5 דקות.
3. באמצעות פה רחב פיפטה 10 מ"ל סרולוגיות העברת מודולים התיישבו על צינור חרוטי 15 מ"ל.
4. חזור על שלבים 6.1-6.3 פעמיים.
5. עבור לשלב 7 כדי מודולים מעיל עם לתאי אנדותל או מודולים להעביר לצלחת ללא רקמה תרבות מטופלים.

7) ציפוי מודולים עם לתאי אנדותל

1. ליישב מודולים לתוך החלק התחתון של צינור חרוטי 15 מ"ל עם 5 מ"ל של המדיה עבור הדואר משובצים בתאים.
2. הסר מדיה מתאי אנדותל ולשטוף עם 5 מ"ל PBS.
3. הסר PBS ולהוסיף 3 מ"ל טריפסין-EDTA.
4. דגירה התאים טריפסין-EDTA במשך 5 דקות ב 37 ° C.
5. Resuspend תאים 7 מדיה מ"ל.
6. ספירת תאים. זקוק 5x10 ⁶ תאים אנדותל לכל מ"ל של מודולים ארוז בחלק התחתון של צינור חרוטי.
7. גלולה התאים XG ב 300 דקות ו - 5 resuspend ב 5 מ"ל מדיה תא האנדותל.
8. מוסיפים 5 מ"ל של התקשורת המכיל בתאי האנדותל של מודולים.
   הערה: זה נותן יחס של 50:50 בין שני סוגי המדיה אשר מצאנו לעבוד ההישרדות והפעילות של שני סוגי התאים. מבחן השימוש מדיום שיתוף התרבות גובשה כדי להבטיח תחזוקה נאותה של פנוטיפים של שני סוגי התאים לפני השימוש בו.
9. דגירה מודולים עם לתאי אנדותל הן סטטי דינמי.
10. לקבלת תערובת סטטי עם מודולים הדגירה לתאי אנדותל על ידי היפוך ולהגדיר את הצינור זקוף על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. חזור.
11. דינאמי זרע לתאי אנדותל ידי מנענעת בעדינות את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
12. חזור הדגירה סטטי פעמיים.
13. מניחים את המודולים צלחת שאינם רקמת תרבות מטופלים דגירה לילה בשעה 37 ° C.
14. המקום למחרת מודולים צלחת הלא רקמה חדשה תרבות שטופלו התקשורת טרי (לערבב 50:50 אם באמצעות שיתוף התרבות המערכת) כדי להסיר לתאי אנדותל פנויות.
15. דגירה מודולים כי הם מצופים בתאי האנדותל עד שהם מכסים 100% מכלל השטח של המודולים. זה בדרך כלל לוקח בערך 7 ימים.

8) נציג תוצאות:

המודולים ייראה גלילי כשהם יוסרו מן הצינור. אם המודולים מכילים תאים משובצים ו / או מכוסים בתאי האנדותל הם יכולים החוזה עד 50% בנפח ולפתח צורה סגלגלה (איור 1). המודולים גם להיות צפופים יותר אטום כאשר נצפים על ידי מיקרוסקופ אור (איור 1). גם כאשר בתאי האנדותל הם ומחוברות על פני השטח של המודולים יש היווצרות של צמתים צמודים אשר ניתן לראות על ידי צביעה immunofluorescence של VE-cadherin (איור 2). העברת ניתוח המוניים הוכיחה כי מודולים מסוגלים לתמוך צפיפות התא גבוה ⁽⁷ 8x10 תאים / ס"מ ³⁾ מבלי לפתח גרעין נמקי כתוצאה תחבורה חמצן לקויה, אשר לעיתים קרובות בעייתית ברקמות גדולות יותר (למשל מודולים של קוטר גדול, D = 1.4 מ"מ) (איור 3).

איור 1: מודול ייצור והתכווצות. התכווצות מודול התרחשו במהלך שלושת הימים הבאים HUVEC-C (קו תאים אנדותל) זריעת תוצאות מודול בקוטר קטן יותר באופן משמעותי ואורך (p <0.001) (A). Embedded HepG2 התאים היו מפוזרים באופן אחיד בכל פעם של ייצור בתוך מודולים שמרו על כדאיות גבוהה (B). [תאים חיים ירוק; תאים מתים אדום] [עיבוד Corstorphine 2010]

איור 2: VE-cadherin מכתים immunofluorescent של צמתים EC תא הדוק 10 ימים לאחר RAEC שבו מצופה על פני השטח של המודול. בר סולם = 50 מיקרומטר.

איור 3: מכתים trichrome של מאסון של מודולים טיפוסי (בקוטר 0.76 מ"מ הראשונית) ומודולים גדול (בקוטר 1.4 מ"מ הראשונית) להדגים את ההשפעה של מגבלות דיפוזיה חמצן. שבעה ימים לאחר ייצור, מספר גדול של תאים מתים יצרו בתוך הליבה של מודולים גדולים (הפאנל הימני התחתון), ומשאיר רק שפה רזה (~ 200μm עבה) של תאים קיימא. לעומת זאת, מודולים קטן שמרה על התפלגות אחידה גבוה של תאים חיים. [מודולים משובץ HepG2 תאים מצופים בתאי האנדותל.] [הפיקוח Corstorphine 2010]

איור 4: (א) HMEC-1 seeded על poloxamine - מודולים קולגן. אחרי יום 1 של זריעת poloxamine-קולגן מודולים לשמור על צורה גלילית שלהם ויש מוגבל מצורף תכונות התא לעומת מודולים קולגן בלבד. בר סולם = 200 מיקרומטר. (ב) מיקרוסקופ אור תמונה של מודול המכיל קולגן PLGA מבוססי microspheres מתכלה. בר סולם = 500 מיקרומטר.

איור 5: דוגמאות של מבחני חוץ גופית. (א) assay אנגיוגנזה: נימי כמו תצורות על מודול seeded עם לתאי אנדותל ניתן לאתר בקלות לכמת לאחר 5 ימים של דגירה עם שומן המופק מתאי גזע. (ב) מיקרוסקופיה Confocal תמונות של assay חי / מת על מודולים שבו staining עבור תאים חיים ירוק עבור תאים מתים אדום.

איור 6: מודולים קולגן המכיל מוטבעים בתאי גזע mesenchymal ושכבת פני השטח של תאים אנדותל. מודולים נחשפו ללחץ גזירה (~ 0.64 dyn / cm ²⁾ למשך 7 ימים בתא microfluidic ולהתחיל להראות היתוך בנקודות המגע. בתאי האנדותל הם מוכתמים vWF (חום) לבין גרעינים mesenchymal בתאי גזע להופיע כחול (H & E). בר סולם = 100μm.

איור 7: מאות מודולים קולגן המכיל שומן, נגזר בתאי גזע (ASC) ומצופה אדם לתאי אנדותל כלי הדם (HMEC) הם מושתל מתחת לעור עכבר ללמוד ASC / HMEC אינטראקציה in vivo עבור יישומים התחדשות שומן.

Discussion

יש לנו מספר מפוברק שונים מיקרו רקמות באמצעות מודולים מוטבע עם סוגי תאים שונים ^1-11. יש לנו מוטבע בהצלחה cardiomyocytes העיקרי, איים, בתאי גזע השומן ותאי סטרומה mesenchymal כמו גם כמה שורות תאים כולל HepG2, NIH 3T3 ו 9 שיבוט תאים בכבד. יש לנו מצופה מודולים עם מספר סוגים של תאים אנדותל כולל אבי העורקים התאים עכברוש אנדותל, אדם וריד הטבור לתאי האנדותל האנושיים לתאי אנדותל כלי הדם. מודולים יש גם הפיק בתערובת של קולגן פולימר poloxamine או משחררי תרופה המכילה microspheres (איור 4). מספר מבחני חוץ גופית הוכחו להיות תואם עם מודולים כולל immunofluorescence, כתם המערבי, אנגיוגנזה, alamar כחול התפשטות מבחני חי / מת (איור 5). יש להם גם נעשה שימוש בתאי microfluidic (איור 6), מושתל לתוך עכברים וחולדות (איור 7) לחקור את האינטראקציה בין תאים מסוגים שונים ואיך מיקרו רקמות שופצה על ידי תשובה המארח. מודולים יש יישומים רבים והוא יכול לשמש לחקר ההשפעה של התרבות רקמת 3D על תאים, האינטראקציה של תאים שונים קונפורמציה 3D, עיצוב מחדש של רקמות מיקרו בתא microfluidic ו בשיפוץ vivo של מיקרו רקמות ידי לארח בתגובה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intramedic tubing PE60	BD Biosciences	427416	Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules
Phosphate-buffered saline (PBS)	GIBCO, by Life Technologies	20012-027
Trypsin-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25200-072
Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL	Cedarlane Labs	5005-B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
20G needle	BD Biosciences	305175	Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing
3 mL syringe	BD Biosciences	309585
15 mL tube	BD Biosciences	352096
50 mL tube	BD Biosciences	352070
Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13”	Cardinal Health	92713
10 ml Wide Tip serological pipet	BD Biosciences	357504
10 ml serological pipet	BD Biosciences	357551
5 ml serological pipet	BD Biosciences	357543